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【求助】蛋白表达及菌体破碎问题
【求助】蛋白表达及菌体破碎问题
我最近做蛋白表达时，蛋白表达量尚可，但就是在超声波碎菌时老是破不碎，后来做了相同条件下未诱导菌体进行破碎，发现很容易破碎，请教各位大侠这是怎么一回事啊？
我的具体操作如下：培养两瓶 200ml BL21（DE）plysS 4小时，OD值0.9，对其中一瓶加入IPTG置37度诱导表达，IPTG终浓度为0.1mmol/l，另一瓶保持不变。诱导过夜，离心收获菌体，PBS洗涤两次后30ml PBS悬浮菌体，超声破碎30分钟（5秒、9秒），保证冰浴。然后对菌体裂解液分别以6000转、12000转离心，SDS-PAGE检测，发现目的蛋白及菌体蛋白绝大部分存在于6000转沉淀中，上清中只有很少菌体蛋白（诱导后的）；而未诱导的则沉淀很少，且菌体蛋白大部分存在于上清中。请各位大侠帮小弟看看是怎么回事？是不是因为我的蛋白表达影响到了菌体细胞壁的结构了？可我的蛋白应该是包涵体表达啊，晕了！
另外，在此前我做了大量的工作对菌体进行破碎，包括反复冻融，溶菌酶，盐酸胍（1-3mol/L，我不想用太高浓度的，尽管可以），DOC，SKL还有一些文献上介绍的一些裂解液配方，均无法破碎，我简直要无语了！
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最新回复
mickeylin (2013-11-05 22:19:49)
1.诱导的温度是否可以在重新调
2.超声的能量你用的多大的数值？是否 在保证蛋白不变性的前提下，加大超声条件，超声时间适当可以延长。直到菌液清亮透明（黄油状）
3.取溶菌酶作用的最佳浓度，同时在反复冻融的过程中要不时的调节pH到它可以发挥最大效力的数值
4.破包涵体以及其它方法的过程怎么样？
5.你用SDS-PAGE检测沉淀中的目的蛋白的分子量怎么样？
6.蛋白表达影响菌体细胞壁的结构这一问题我也想知道
云端ing (2013-11-05 22:20:16)
QUOTE:
1，诱导温度我以前用的20度，后来发现37度诱导表达量较高就采用了37度，但对破碎效果的影响我正准备再试试。2，我用的超声仪属于前辈级机器（但保证能用），我也不知道具体功率的大小，只知道以往所用均为35%~45%，我用的是38%。超声时间我延长过，但诱导后的始终均是浑浊菌体悬液。甚至有时发生分层，估计是变性了。
3，溶菌酶我用的效应浓度为1mg/ml，PH8.0，37度水浴1h，不管用。不知道你一般用多少浓度？溶菌酶能否与其它一些低浓度的离液剂或者去污剂联用？
4，冻融法也用过，-20--37度，3次，不管用。再者就是一些裂解液，效果实在让人郁闷。
5，SDS-PAGE 检测沉淀中确实是目的蛋白，与全菌直接检测分子量相同。不知你对这一点有什么想法？
6，不知哪位大侠对蛋白表达是否会影响菌体胞壁结构这一问题不吝赐教？
dmg (2013-11-05 22:20:40)
供讨论
1.诱导温度的选择是以什么为标准（产量与表达蛋白的分离率）建议查文献核实
2.菌液离心后上清做SDS-PAGE检测。看是否有目的蛋白，并收集。多次洗细菌沉淀并重悬细菌，超声只破碎离心收集的细菌细胞（防止菌液内已经有的蛋白在超声时与细菌一起超声变性发生分层）
3.超声破碎细菌细胞,并纯化包含体后裂解释放包涵体，离心收集上清跑电泳看是否有目的蛋白，有收集，并收集包含体，对其处理如下（包含体的处理是我在园子里找到的，你在园子里搜索一下）
10 000 r·min - 1离心15 min ,弃上清。
将沉淀用3 mol·L - 1尿素含0. 2 g·L - 1 TritonX2100 反复洗涤处理得到纯化的包涵体, 称重。
包涵体用8 mol·L - 1 尿素含10 mmol·L - 1二硫苏糖醇(DTT) 溶解变性。
复性:
包涵体溶解变性后10 000 r·min - 1离心15 min ,清除不溶性杂质。
上清直接用复性液: 50 mmol·L - 1 Tris·Cl , 1 mmol·L - 1 EDTA , 1 mmol· L - 1苯甲基磺酰氟(PMSF) ,不同浓度的氧化型谷胱甘肽( GSSG) ,还原型谷胱甘肽( GSH) 稀释,使蛋白质终浓度不超过100 mg·L - 1 ,尿素终浓度为0. 5～ 1. 0 mol·L - 1 ;在其他条件不变的情况下,分别改变GSSG和GSH 浓度、温度及复性时间,PEG20000 浓缩后,离心。
测上清总蛋白质量,计算复性率,找出最佳复性条件。
4.溶菌酶10mg/ml。在作用过程中菌液的pH会下将，所以最好多次重新调节pH>8(你查一下它的作用原理以及大肠杆菌的特性就知道）
5.冻融法我们是10次，最少六次
6.我感觉蛋白表达影响菌体细胞壁的结构的可能性较小，主要还是包含体的处理上（我也是新手）见笑了，供大家一起学习
7.关于前辈级机器，如果前辈用可以，那么你应该在自己漠漠条件了
不请自来 (2013-11-05 22:21:01)
1.菌体破碎的检测指标:镜检,才可直观知破全没有?
2.反复冻融，溶菌酶，盐酸胍（1-3mol/L，我不想用太高浓度的，尽管可以），DOC，SKL还有一些文献上介绍的一些裂解液配方，均无法破碎?
这些方法我都试过,菌是BL21（DE3）均无问题.你不成功的原因可能在于细节.
3.未诱导的则沉淀很少，且菌体蛋白大部分存在于上清中
结论是对的
4.IPTG置37度诱导表达，IPTG终浓度为1mmol/l，3.5-4.5小时是最佳时间,再长则减.你可做单因子优化.
5.超声破碎30分钟（5秒、9秒），保证冰浴。然后对菌体裂解液分别以6000转、12000转离心，SDS-PAGE检测，发现目的蛋白及菌体蛋白绝大部分存在于6000转沉淀中，上清中只有很少菌体蛋白（诱导后的）
结论正确,但还可优化
但要注意超声的声音,如声音有异,则是没有工作.原因参数设置不对,产热,温度高,间隔时间太短.
如还有问题MSN,同名帐号,工作时间在线.
云端ing (2013-11-05 22:21:28)
1，镜检或许是检测菌体破碎的金指标，但如果菌体有破碎，包含体是不应该在6000转沉淀下来啊，分级离心后电泳检测应该也可以说明一点问题。不过下面我会用镜检做一下看。
2，反复冻融、盐酸胍（1-3mol/L）我重复过，确实不行。溶菌酶有可能是PH控制不好，我会重做再试试。DOC我用2％，悬浮后能释放核酸（悬液变粘稠），但超声破碎效果确实不行，我分别取了20分钟、60分钟和90分钟的超声裂解液电泳检测。SKL效及其它只做过一次，效果更差。
3，IPTG诱导我做过优化，终浓度0.1和1mmol/L没有太大区别，所以我一直用0.1。
4，我一直搞不明白，同等超声条件下为什么未诱导菌体可以很容易破碎，而诱导表达后就不容易破碎了呢？这应该不是超声的原因吧，否则未诱导的也不应该破碎啊
蛋白表达我刚接触，纯粹的新手，希望能多多指教。
dmg (2013-11-05 22:21:48)
1.用不用溶菌酶都无多大关系.,
2.DOC用2％,悬浮后并不能释放核酸,悬液变粘稠是由于DOC.
3.IPTG诱导我做过优化，终浓度0.1和1mmol/L没有太大区别，所以一直用0.1?
优化方法不对
同时做时间双因子\培养基多因子
温度20度可分泌表达,诱导过夜
4.破碎只用缓冲液即可
5.包含体是不应该在6000转(4000g)可沉淀80%
可找我以前发的超声破碎帖子作参考
huifeng0516 (2013-11-05 22:22:07)
我也在作pET载体在BL21(DE3)中的表达，目的蛋白的表达量尚可，可是纯化后在洗脱液中看不到目的蛋白，不知道蛋白哪里去了，我现在最烦恼的事情就是细胞的破碎问题，
溶菌酶破碎差，我决定用超声波，我发现超声波容易导致溶液起泡沫，起了泡沫的蛋白就变性了是吗，即使真的使蛋白变性，用His-bind resin就不能亲和
纯化了么，好郁闷！
c86v (2013-11-05 22:22:38)
我也是做pET载体在BL21(DE3)中的表达，我觉得如果洗脱液里没有蛋白，那很可能是目的蛋白在流出液中，也就是它没和介质亲和上．你的裂解液的PH值是8.0吗？我看过一本书上面说在8.0时介质比较容易和目的蛋白亲和．
另外，我是用超声破碎的，在冰浴中，有时操作不好也会起沫，可是过柱后也可以回收到目的蛋白的，而且我是在变性条件下回收的，所以我想尽量少起泡沫就可以纯化出来了吧．
#甜# (2013-11-05 22:22:58)
是你操作的问题,加大超声液的用量,超声头深入液内.在冰消融过程中调整超声头位置,不要出液面,否则很易现泡.
起了泡沫的蛋白可能会变性!
gemei0115 (2013-11-05 22:23:28)
你以前以为破菌不完全的原因：
诱导时间太长，没有人在37度诱导过夜，这样的话菌都已经死了，而且都自溶了，所以你离心收菌得到的已经都是包涵体和少量没有自溶的菌体，这样无论怎么破菌上清里都没有多少菌体蛋白了。你的没有加IPTG的对照就很正常，没有这种自溶现象。
不知道你的6000转无法离心下来包涵体的概念是怎么来的。首先6000转的说法就不科学，应该根据你使用的转头半径大小换算成g，才能反映真实离心力大小，现在的新离心机上都能直接看到g。再说一般的转头6000转已经能把大部分包涵体沉淀下来了，如果时间够长，包涵体基本上都能沉淀下来。
你的电泳照片显示你的目的蛋白在包涵体里，6000转已经把90％以上的包涵体沉淀下来了。12000转出现的两条主要的杂带我认为不存在于包涵体里，而是位于细胞膜上的膜蛋白，12000转（拜托换算成g）把细胞膜的大碎片离心沉淀下来了。
建议只用6000转离心下来的还算比较纯的包涵体，扔掉12000转的沉淀。
云端ing (2013-11-05 22:24:25)
取1ml裂解液分别以6000转、12000转离心分获沉淀和上清，洗涤沉淀后，制样跑电泳，发现目的蛋白仍主要存在于6000转沉淀中（箭头所示），但与以往不同的是，6000转的菌体蛋白少了，而12000转菌体蛋白较之以往有所增加。与之相对应的一杂蛋白（椭圆所示），与目的蛋白恰好相反，主要存在于12000转沉淀，如果此杂蛋白是包含体形式的话，那么我的目的蛋白又是以什么形式存在的呢？
附图如下：从左至右依次为6000转、12000转、上清和Marker。请各位大侠指教！
66943310.jpg
云端ing (2013-11-05 22:24:45)
QUOTE:
1,诱导时间太长，没有人在37度诱导过夜，这样的话菌都已经死了，而且都自溶了?不敢苟同老兄的意见。虽然我用的菌是BL21（DE）plysS ，可以表达少量T7溶菌酶，但它在细胞内部是不能攻击细胞壁的，也就是说它只能在细胞破碎以后才能发挥有限的溶菌效果，这也恰恰是我用这个菌的目的之一。况且你的说法，与我涂平板的结果也不甚相符合。
2，6000转的表述方法的确不是很准确，这与所用离心机及所用转头有关，这是我的失误。我所用离心机为Sigma 1-13， 最大转速： 13.000rpm 、最大离心力：11.340 x ɡ，所以6000转换算成离心力也就5000g左右吧（这样对吗？请高手指教），在这样的离心力下一般是只能离出较大的细胞碎片的，包含体大小一般为0.5-1um，受到溶液浮力、相互静电斥力、布朗运动等因素的影响，必须在一定的离心力下才能沉淀，与离心时间是无关的，而这个离心力一般是12000g(好像在哪篇文献看到过，记不清了。分析是否正确？请高手指教。)
3，12000转出现的两条主要的杂带我认为不存在于包涵体里，而是位于细胞膜上的膜蛋白，12000转（拜托换算成g）把细胞膜的大碎片离心沉淀下来了？
细胞膜的大碎片不能够在6000转（5000g）离心下来吗？
gemei0115 (2013-11-05 22:25:18)
QUOTE:
看得出你是一位很认真的朋友，所以我会尽量找出根据来回答你。1，37度诱导过夜导致菌体死亡破裂，不是因为你的plyss菌自身表达溶菌酶的原因，而是由于iptg的细胞毒性，一旦诱导，细胞的主要生理活动都向着目的蛋白表达的方面转化。在通常情况下，细胞将停止生长，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。在37度环境中，3－4小时内细胞都不会死亡。
但是如果过夜诱导，在这样的温度和营养已经耗尽的情况下，细胞应该会死掉一些，正好你的plyss菌自身的溶菌酶会加速这个过程，所以才会出现你描述的情况。所以大家在37度诱导时都是只诱导3－4小时。
因为没有人在37度诱导过夜，所以找不到根据支持我的观点，你涂平板的结果也不太能说明问题，我并没有说你的菌全部死掉了，不过你可以做一个稍微严谨一点的试验来验证一下我的推断，在同样的条件下37度过夜摇你的表达菌，一个加iptg，一个不加，然后分别稀释到合适的浓度涂平板培养，计算活菌数，我估计将会有1到2个数量级的差别。
2，如果你看过包涵体的电镜照片，你会发现包涵体还是很大个的，直径跟细菌差不多，而且密度很大，肯定是可以在6000转离心下来的。你可以看看这个protocol，也许对你的试验有帮助。 cuturl('http://www.fhcrc.org/labs/strong/StrongLabRefoldingProtocol.pdf') 他们就是6000转离心包涵体，Centrifuge to collect inclusion bodies (for example, 6000 rpm for 15 minutes)，这个protocol有好几个经典文献支持，而且我认为他用6000转是有目的的，因为可以避免离心下来细胞膜碎片，使包涵体更纯。
3，我提过大肠杆菌膜蛋白，先是低速离心（肯定超过6000转，具体多少忘了），然后取上清4万5千转（or g）离心一小时得到细胞膜沉淀。所以低速离心是离不下来细胞膜的，应该是含有太多脂类物质密度太小的原因吧。
看你的id，是不是学蛋白晶体专业的？希望继续讨论^_^
koook5695 (2013-11-05 22:25:43)
1.从电泳来看，你做得还不错。
2.时间双因子：诱导前时间、菌浓；诱导后时间
3.培养基多因子优化：培养基成分
4.取了100ul与全菌对照涂平板培养，发现还是长出了菌落，这是不是也可以说明细胞并未破碎啊？
标准不对，存在误差，镱检才是标准。
5.杂蛋白是包含体形式的话，那么我的目的蛋白又是以什么形式存在的呢？
杂蛋白不是包含体形式存在。目的蛋白是包含体。
离的速度、时间还可少。
veiwu (2013-11-05 22:26:04)
【求助】蛋白表达及菌体破碎问题