【求助】提RNA过程影响纯度和质量的关键是否...

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• xevin (2015-8-03 10:57:29)

  
  为什么不离心呢？12000转 15分钟！RNA的提取涉及到每一步，应该按照规程做才能保证结果有效。

• H2O (2015-8-03 10:57:52)

  
  离啊,我的意思是说,氯仿离心之前观察一下分层情况,可能有助于判断RNA纯度;
  可能没表达清楚,再改过了,请大家看看

• am10 (2015-8-03 10:58:16)

  
  我也不是很清楚是否在离心前观察分层的情况意义很大
  不过的确存在有时侯 提的好,有时后提的差,个人认为和组织或是细胞的量关系挺大的

• H2O (2015-8-03 10:58:37)

  
  纯度与组织或是细胞的量确实相关,不过前提是TRIZOL加的量少;
  
  如果加与组织或细胞相适应的TRIZOL量就可以充分裂解,去除蛋白了

• gmt (2015-8-03 10:59:27)

  我也碰到这个情况，以前提得都挺好，加氯仿振摇，离心前看到明显分层，但后来做的都无明显分层，离心后上清也少，仔细回想分析也不知是何缘故。

• qianqin1977 (2015-8-03 10:59:50)

  
  我也遇到类似问题，无明显分层，或离心后上清很少，会影响RNA提取结果吗？我也认为与细胞数量有关系。

• ending (2015-8-03 11:00:19)

  请问你提取的是细胞的还是组织的RNA吗？
  如果是细胞我们的做法一般是加入1ml TRIZOL到EP管后，振荡，然后再冰上放置15－20分钟左右，后面就加0.2ml的氯仿，振荡器上剧烈振荡30秒，室温放置2、3min，再冰上放置20分钟，一般都可见到分层的，然后12000 离心20min，取上清，加等体积异丙醇-20度过夜，然后再12000 离心20min，去上清，加预冷的75％乙醇吹打漂洗，7500 离心10min，再去上清，晾干至半透明，加无RNA酶的水溶解。
  如果是组织的，我们一般是取100mg的组织，加入1ml TRIZOL到匀浆管中，充分匀浆（冰上）至肉眼看比较均匀为止，大约1-2分钟吧，然后室温放置2、3分钟后，再加0.2氯仿，振荡，后续步骤就是一样的了。
  每次做我们都可以看到明显的分层，如果是组织的，我们做的比较多些，第一次离心后一般可以取到500－600ul的上清的。我们实验室一直是这样做的，比值基本都在1.8-2.0左右。
  我觉得TRIZOL和氯仿失效的可能性不大，由于我们的实验经费有限，有时我们用的都是师兄师姐剩下的没用完的TRIZOL，买来都有1年多的时间呢，一直在4度放着的，我做过提出的RNA也没有问题。

• 2541 (2015-8-03 11:00:40)

  
  我在提取外周血单个核细胞RNA的时候也是出现RNA纯度不高且不稳定的情况，我用的是国产的Trizol，同样加1ml，加样器吹打1分钟（每次都吹得我手痛！），转移至Ep管，室温放20分钟，加氯仿200ul，剧烈振摇1分钟，冰上放置15分钟，每管均可见分层，故个人认为吹打是否充分和放置时间对RNA提取有影响；离心后可得上清600ul左右；再经异丙醇和75%乙醇处理后，1%琼脂糖电泳可见清晰28s和18s带，但RNA比率经常在1.3-1.6左右，我也为此苦恼，且下面的RT过程进行的并不顺利，连内参也扩的很淡，有大虾可否告我，我提的RNA有蛋白污染的话，对RT过程是否有影响？国产的Trizol是否提取效果不好？

• vvmmoy (2015-8-03 11:00:59)

  
  我的经验是，从组织中用TRIZOL提RNA时组织的量并不是越多越好，在一定范围内是正好相反。我曾经做过对比，同一块组织经匀浆后做一定稀释，分别取50、100、150、200ul匀浆液提RNA做反转录PCR，除了组织的量不同外其它条件都一致，结果只有50ul的样品扩出了所需要的目的片段，经克隆测序验证正确。

• u234 (2015-8-03 11:01:30)

  
  1000000个细胞可以提出RNA吗？我提外周血单核细胞的，每次加异丙醇沉淀时可见到一层浑浊，但到最后测RNAOD值时就出现负值来，是降解了还是什么原因？

• 2541 (2015-8-03 11:02:57)

  我觉得提RNA的关键是Trizol的量要足，一般是10*6~10*7细胞加1ml Trizol，细胞数太多，Trizol的量相对就不足，裂解不完全，影响RNA的质量。一定要充分吹打混匀直至溶液澄清！！这时可以加氯仿往下做，也可以放在－20℃下冻存起来，到需要时再往下做，我放过一个多月再提RNA还是好的。另外加氯仿后要充分振荡混匀呈乳状，然后在室温下静置3~5分钟再去低温离心，分层都很明显，一般都有500~600μl的水相。后面的步骤就是沉淀、洗涤的过程了，最后用DEPC水溶解，按照程序来就ok了！加入异丙醇后也要在室温下静置10分钟再去离心比较好，也有的说在－20℃下静置，我试过，差不多，我感觉在室温下效果还要好一些！

• whitesheep (2015-8-03 11:05:30)

  您指的“匀浆后做一定稀释”，是从匀浆后的裂解液中取50、100、150、或200ul出来吗，那么用什么稀释它呢？稀释到多大体积，加多少体积的氯仿呢？
  另外1ml的裂解液取多大的组织块最好？说明书是50-100mg，我觉得这个范围还是大些？如果大家有这方面的经验，恳请指教！！！
  
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  我的经验是，从组织中用TRIZOL提RNA时组织的量并不是越多越好，在一定范围内是正好相反。我曾经做过对比，同一块组织经匀浆后做一定稀释，分别取50、100、150、200ul匀浆液提RNA做反转录PCR，除了组织的量不同外其它条件都一致，结果只有50ul的样品扩出了所需要的目的片段，经克隆测序验证正确。

• mickeylin (2015-8-03 11:06:02)

  
  我觉得,提取RNA正如southern 战友所说的Trizol的量要足,特别是一些含内源性RNA酶丰富的组织如肝脏、脾脏和胰腺,如果Trizol的量不足将很难彻底抑制RNA酶,也不利于RNA的提取;还有对于那些胞浆蛋白丰富的可以适当增加氯仿的用量,能使中间的分层很明显,我有时加0.25~0.3毫升的氯仿,结果也挺好的;在吸取上清水相时我觉得一定要将移液器吸咀贴离心管壁轻吸,防止吸入蛋白成分.
  加异丙醇的量我们一般和前面吸取的水相大概是1:1的比例,比如吸取0.5毫升水相就加0.5毫升的异丙醇.
  反正主要还是要小心操作防止RNA酶污染,特别是从氯仿和异丙醇以后的步骤,因为这时的RNA已没有了保护.

• www.1 (2015-8-03 11:06:29)

  
  我觉得上面的上面的师兄说的很好,"在吸取上清水相时我觉得一定要将移液器吸咀贴离心管壁轻吸"。
  我现在试着从骨骼肌组织提RNA，跑电泳点样孔附近无明显亮带可见，但OD值始终在1.3-1.5,说明还是有蛋白或酚等污染对吗？
  虽然琼脂糖电泳可见清晰三条带，无smear降解片状影出现，但5s最亮，28s最暗，逆转录后PCR也没有产物。我想可能就是RNA中混有了蛋白或酚，影响了逆转录过程，对吗？
  最后用乙醇洗涤的步骤，是不是和OD值偏低也有影响？因为用异丙醇沉淀后，rna已成胶状沉淀，加乙醇后用不用轻弹管壁至RNA完全溶解后再去离心？
  请多指教，谢谢！

• mickeylin (2015-8-03 11:07:15)

  我现在试着从骨骼肌组织提RNA，跑电泳点样孔附近无明显亮带可见，但OD值始终在1.3-1.5,说明还是有蛋白或酚等污染对吗？
  虽然琼脂糖电泳可见清晰三条带，无smear降解片状影出现，但5s最亮，28s最暗，逆转录后PCR也没有产物。我想可能就是RNA中混有了蛋白或酚，影响了逆转录过程，对吗？
  最后用乙醇洗涤的步骤，是不是和OD值偏低也有影响？因为用异丙醇沉淀后，rna已成胶状沉淀，加乙醇后用不用轻弹管壁至RNA完全溶解后再去离心？
  请多指教，谢谢！
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  一般来说,提取的RNA OD值偏低可能混有蛋白污染,RAN实际上在酒精洗涤时是不溶解的,应该看到的是白色沉淀,洗时我觉得应该把轻弹管壁弹能够充分洗涤.
  逆转录后PCR没有产物的原因很多,不知道你有没有同时跑内参,如果能跑出内参说明你的反应体系是好的;有的RNA有轻度降解时照样能跑出内参， 但对于目的基因特别是长片段及表达不高的就困难了,能否跑出目的基因还要看退火温度,退火温度不合适,也跑不出,当然引物也有关系.

• milkdog (2015-8-03 11:07:44)

  
  我观察到氯仿异戊醇很容易从TIPS上滴落一滴，就这一滴很容易部分层
  在加一滴后一会就分层

• langlang (2015-8-03 11:08:07)

  提RNA两个步骤最关键：一是组织的量和在TRIZOL中的溶解程度。100mg/1MLTRIZOL足够了。关键在于敲碎组织（一定要注意在室温中不要太久，期间可在液氮中冷却一下）和反复吹打组织块，使组织块反复通过枪头，直止看不到组织块，这个过程需要几分钟，看熟练程度了。这一步主要是保证有足够的RNA融出，保证量。第二，在加过氯仿离心吸取上清时，千万不要搅动中间的白色DNA膜状物。可50ul50ul地贴壁吸，大概总量在500UL，不要贪多，最后一下坏了一管，少50U，少不了多少RNA，这一步是保证质量。其实做的不够好是因为许多细节没有注意到。LUCK！

• woshi (2015-8-03 11:08:37)

  
  提RNA确实是有很大的操作差别的，不同人做的结果就算是同一试剂，同一材料，同时做都有可能结果差别很大。对于影响结果的原因有：
  1.Trizol试剂的问题，因为Trizol里面有酚，而酚是会挥发的，所以试剂保存时间不能太长，尽量避免在较高温度条件下敞口放置。（我实验室一哥们把新订的Trizol室温放置了一个晚上，后来用就不太好了）
  2.操作上的问题：1）裂解细胞时一定要把细胞轻轻吹打分散开，不要有成团的，但也不可使劲吹打；2）加入氯仿后的振荡很关键，要是votex的话就过于剧烈了，应该用手使劲的上下左右振荡，这样既能尽可能的把RNA萃取出来，又最大限度的避免了基因组DNA的污染。
  基本上主要的影响就是这些了，一般注意了这些就可以得到较好的重现性了。

• whitesheep (2015-8-03 11:09:06)

  
  那如果组织用超声细胞仪粉碎和用匀浆有区别吗，超声粉碎会切断RNA吗

• zzzz (2015-8-03 11:09:32)

  我觉得提RNA的关键是Trizol的量要足，一般是10*6~10*7细胞加1ml Trizol，细胞数太多，Trizol的量相对就不足，裂解不完全，影响RNA的质量。一定要充分吹打混匀直至溶液澄清！！这时可以加氯仿往下做，也可以放在－20℃下冻存起来，到需要时再往下做，我放过一个多月再提RNA还是好的。另外加氯仿后要充分振荡混匀呈乳状，然后在室温下静置3~5分钟再去低温离心，分层都很明显，一般都有500~600μl的水相。后面的步骤就是沉淀、洗涤的过程了，最后用DEPC水溶解，按照程序来就ok了！加入异丙醇后也要在室温下静置10分钟再去离心比较好，也有的说在－20℃下静置，我试过，差不多，我感觉在室温下效果还要好一些！
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  完全赞同。组织量令少勿多
  RNA提取少不怕，就怕DNA污染