【求助】求助

最新回复

• JK.jon (2016-1-12 16:09:14)

  
  我的细胞总是圆形，但是贴壁，生长缓慢，烦劳各位支招

• finger (2016-1-12 16:09:40)

  
  脂肪基质细胞的培养国外技术已经比较成熟了
  我已经做了2年，积累了一些经验，可以交流一下！

• rfv (2016-1-12 16:10:37)

  
  我用脂肪组织培养出前脂肪细胞，经诱导后可分化为成熟脂肪细胞，但分化率不是很高。

• finger (2016-1-12 16:10:58)

  
  你是用的人的还是鼠的细胞？
  前脂肪细胞形态如何？

• summerxx (2016-1-12 16:11:22)

  
  我养过，但是是大鼠的，我的实验方法如下：
  实验方法：
  1．大鼠前脂肪细胞的原代培养：颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精浸泡消毒15min，切取皮下脂肪组织约10g。Hanks液洗涤，分离去除脂肪组织中肉眼可见的纤维成份及血管。剪碎成约2mm×2mm的小块，加入消化液，置37℃，空气摇床100rpm消化。2hr后，1000rpm离心5min，去除漂浮的脂肪细胞及培养液，沉积的细胞用红细胞裂解液再次配成细胞悬液，37℃孵育10min，以去除污染的红细胞，150μ尼龙网过滤，Hanks液洗涤并离心2次，每次1000rpm,5min。沉积的细胞用培养基A制成细胞悬液，调节浓度2×105/ml接种于培养瓶中。置37℃，体积分数5%CO2培养箱内孵育72hr后，细胞换液，一周以后可以传代。
  2.细胞的分化：细胞贴壁72hr后Hanks轻轻洗去培养瓶内未粘附的物质，换用培养基C诱导和维持脂肪细胞分化，3d以后更换为培养基B，以后每三天换一次液。
  培养基A（增殖培养基）： DMEM/F12　11.2g/L
  10%小牛血清,
  L-Glutamin 0.35g/L
  Hepes 15mmol/L
  NaHCO3 15mmol/L
  青霉素 100U/ml
  链霉素 100ug/ml
  培养基B（诱脂培养基1）：DMEM/F12　11.2g/L
  NaHCO3 15mmol/L
  Hepes 15mmol/L
  泛酸盐 17µmol/L
  生物素 33µmol/L
  人转铁蛋白 17µmol/L
  青霉素 100U/ml
  链霉素 100ug/ml
  氢化可的松 100nmol/L
  胰岛素 60nmol/L
  T3 0.2nmol/L
  培养基C（诱脂培养基2）：DMEM/F12　11.2g/L
  10%小牛血清,
  IBMX 0.25mmol/L
  L-Glutamin 0.35g/L
  Hepes 15mmol/L
  NaHCO3 15mmol/L
  青霉素 100U/ml
  链霉素 100ug/ml
  0.22µm过滤除菌，-20℃保存。
  消化液：胶原酶Ⅰ　　 150mg
  　　 牛血清白蛋白　　2g
  0.01M的PBS定容至100ml
  2.2红细胞裂解液：EDTA 0.1 mM
  　　　　　　 NH4Cl　　 150mM
  　　　 K2HPO4 5.7mM
  －－－－－－－－－－－－－－－－－－－
  打字打得我累死了，有没有加分啊？不过这段我硕士论文也有用

• ero11 (2016-1-12 16:11:46)

  
  好激动啊！我用的是小鼠3t3l1细胞，可复苏后半死不活，总是圆形虽然贴壁。我复苏时不离心，第二天换液。方法是否存在不妥，烦劳各位指教。多多感谢。

• qhyu (2016-1-12 16:12:13)

  我复苏时不离心
  -----------------------------------------------------------------
  您这是什么意思？不离心怎么复苏啊？
  另外，细胞圆形的说明贴壁没贴上。
  复苏后用PBS洗过没？要把冻存液洗干净。

• 49888 (2016-1-12 16:12:29)

  
  有报道说复苏只要把细胞直接接种到培养瓶里就ok了，因为离心损伤也大，但是我第二天换液的，洗掉冻存液。
  咱养的细胞一样？

• 孢子11 (2016-1-12 16:12:49)

  非常感谢您所提供的帮助,我计划养人的前脂肪细胞,你的方案对我很有启发。还有几个问题想请教一下。
  1 .前脂肪细胞一般传几代以后增殖能力降低？
  2. 对内皮细胞污染你是如何处理的？
  3. 培养基C（诱脂培养基2）中IBMX的作用是什么？
  4. 诱导的成熟脂肪细胞是如何鉴定?凭外观和苏丹3染色可以吗?
  5. 10g样本,能获得大概多少成熟脂肪细胞
  6. 从取一份样本到诱导分化成功脂肪细胞大概需多少钱,我老板的银子可不多啊.
  非常感谢!

• join (2016-1-12 16:13:09)

  这我也听过这种说法，也试过，但是不把冻存液洗干净，细胞好像就不爱帖壁，至少我的细胞是这样的。我是用鼠胚成纤维细胞试过。

• join (2016-1-12 16:16:26)

  前脂肪细胞的培养现在多用于软组织工程和减肥药物的研发。不知你是想向哪个方向研究。对于你的问题，我知道的可以告诉你答案：
  1、我的经验是五六代以后就增殖力不行了。但是我查文献，看到米国有个牛实验室，一气儿传了二百多代，看他们的实验方法和我也差不多，不知道诀窍在哪里。那篇文章一时找不到了，找到再给你看吧。
  2、我是用胰酶消化法。发现内皮细胞污染后，用胰酶和EDTA消化。镜下观察。内皮细胞消化很快，大约一分钟后就可以看细胞缩小，这里把内皮细胞吹下即可。
  3、IBMX是甲基异丁基次黄嘌呤。我是在sigma订的，贵，900多100mg。它的作用是促使脂肪细胞分化基因重排。
  4、对，这样也可以。其它供参考的指标有：油红O，GPDH，PPAR等。
  5、大约一千万左右吧
  6、我共计花了二三千块：包括，IBMX 900，胰岛素，T3、转铁蛋白，共计一千多，胶原酶300多，还有就是几只大鼠啦，每只25(8过这笔钱你就不用啦)，再算上那些一次性培养瓶什么的，精打细算三千可以搞定。

• join (2016-1-12 16:31:33)

  前脂肪细胞的培养现在多用于软组织工程和减肥药物的研发。不知你是想向哪个方向研究。对于你的问题，我知道的可以告诉你答案：
  1、我的经验是五六代以后就增殖力不行了。但是我查文献，看到米国有个牛实验室，一气儿传了二百多代，看他们的实验方法和我也差不多，不知道诀窍在哪里。那篇文章一时找不到了，找到再给你看吧。
  2、我是用胰酶消化法。发现内皮细胞污染后，用胰酶和EDTA消化。镜下观察。内皮细胞消化很快，大约一分钟后就可以看细胞缩小，这里把内皮细胞吹下即可。
  3、IBMX是甲基异丁基次黄嘌呤。我是在sigma订的，贵，900多100mg。它的作用是促使脂肪细胞分化基因重排。
  4、对，这样也可以。其它供参考的指标有：油红O，GPDH，PPAR等。
  5、大约一千万左右吧
  6、我共计花了二三千块：包括，IBMX 900，胰岛素，T3、转铁蛋白，共计一千多，胶原酶300多，还有就是几只大鼠啦，每只25(8过这笔钱你就不用啦)，再算上那些一次性培养瓶什么的，精打细算三千可以搞定。

• 7437654 (2016-1-12 16:32:07)

  很感谢你能够回应。前天我们复苏的细胞离心了，1000转5分钟，第二天是圆形贴壁，有部分梭形细胞，可今天一看，哇噻，全部崩解了，怎么回事咯？难道培养基的问题，我们用的dmem培养基，原先用的是dmem/f12，请问：
  俩者有啥区别？
  忽然换培养基影响么？
  谢了。

• seagate (2016-1-12 16:32:35)

  F12中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以在血清很少的情况下应用，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。
  细胞崩解可能是复苏的条件没有掌握好，细胞活性差；或者是培养基的pH等问题，原因很多，不好说
  换用DMEM短期影响不会很大

• ns5fan (2016-1-12 16:32:54)

  你说的崩解是什么意思？浮起来，还是碎裂了？
  如果是后者的话，同意楼上的，检查培养液的PH，还有，你的培养液在4度放了多久了，超过二十天就会出问题，里面的gulutamine啦什么的会分解(当然，如果买的是标明含stable glutamine的例外)。
  另外，复苏时的原则是慢冻快化，即融化时要快快的，放在37度快化开。不然产生冰晶会损伤细胞(这可能是废话了，你十九知道。)可以再检查一下液氮桶是不是没液氮了？

• guagua (2016-1-12 16:33:11)

  真是高兴这么多朋友帮助我的那些宝贝。他们是碎裂了。我们的过程是
  1 上午把在－20度冻存的培养基拿出，放在室温平衡（是不是不该在室温平衡啊）
  2 下午加入胎牛血清，调ph到7.2。随后小滤器过滤培养基。
  3 液氮中取出38度1－2分钟，离心1000转5分钟。接种到俩个培养瓶中。
  此过程如有纰漏，望各位不吝指出
  还有，我们的培养基早就配好，放在－20度，但是结冰后可以看见瓶口有发紫红的培养液滴，可瓶子灌的也不是很满啊。大概80％吧。

• ns5fan (2016-1-12 16:33:30)

  我的疑问是：
  为什么你从-20度取出培养基后还要再过滤？？难道在冻之前没有滤过？？如果是这样，我的看法是：冻之前没过滤，即使在-20℃保存，还是会有微量细菌增殖，从而会消耗培养液中的营养物质。所以，是细菌抢掉了你宝贝细胞的营养哦!

• ns5fan (2016-1-12 16:36:15)

  另外，我的习惯是，配完的培养液在六小时内过滤掉(无论如何不要超过24hr)，防止里面细菌增殖，吃我的营养啊。
  我看你在室温下还放了大半天，余颇不以为然也，呵呵,开个玩笑啦。Big Smile
  而且，血清最好事先灭活(56℃15min)，然后等培养液过滤好以后再加入。因为血清中有许多成份分子蛮大的，放在滤器里一滤可能就滤没啦。

• 555444 (2016-1-12 16:36:33)

  我们在放到－20度前用大滤器滤过了，为了保险我们在作之前都要用小滤器再过滤一次，还有，小牛血清不过滤就加入不怕污染么？
  诶，郁闷之至。我们的细胞今早晨看全部污染，连同一直没有碰过的几瓶。可我们前些日子刚打扫了孵箱啊。孵箱的细胞是不同时间不同人冻的，培养基用的都不是一批，复苏时间也不同，
  咋办泥？

• jude (2016-1-12 16:36:52)

  
  是什么污染，霉菌吗？
  如果是的话，那可能是孵箱被霉菌污染啦。
  以前看见有人教过的方法，是高锰酸钾：甲醛=30颗：60ml 。熏蒸12小时。
  小牛清血制备过程是无菌的，56度灭活即可，不必滤。