研究蛋白质-RNA相互作用的新工具
近日，赛默飞世尔科技全新推出了一款Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit，让研究人员能够以末端标记的RNA作为诱饵，轻松富集蛋白质-RNA的相互作用。与抗体捕获相比，这种方法的优势在于脱硫生物素化的目标RNA能够直接富集RBP(或复合物)。
蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。了解它们之间相互作用的分子机制对理解这些生物学过程非常重要。然而，之前的分析方法往往受限于使用放射性标记，或实验步骤过多，不仅耗时费力，也增加了实验结果的不稳定。
近日，赛默飞世尔科技全新推出了一款Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit，让研究人员能够以末端标记的RNA作为诱饵，轻松富集蛋白质-RNA的相互作用。
此试剂盒利用脱硫生物素末端标记的RNA和链霉亲和素磁珠标记的来高效富集RNA结合蛋白(RBP)。与抗体捕获相比，这种方法的优势在于脱硫生物素化的目标RNA能够直接富集RBP(或复合物)。此外，试剂盒还提供了经过验证的对照，适用于标记和pull-down分析，也与多个下游应用兼容，如Western blotting和质谱(MS)。
试剂盒中包含了Pierce RNA 3’-End Desthiobiotinylation Kit。它利用T4 RNA连接酶将单个脱硫生物素化的胞苷二磷酸连接到单链RNA的3’端。3’端的末端标记不干扰RNA结构，因此，比标记核苷酸的随机掺入更加理想。每个标记反应适合50 pmol RNA;不过，如有必要的话，标记反应也可扩展(从1 pmol到1 nmol)。标记反应需要20倍过量的脱硫生物素化核苷酸。对于不太复杂的RNA，孵育时间可为37°C 30分钟，若是更长或更复杂的RNA，时间也延长到4-16°C过夜。通过改变RNA与核苷酸的比例，延长孵育时间，或在标记反应中添加DMSO，可优化复杂RNA的标记效率。
RBP的富集过程经过优化，相当简单。首先将RNA与链霉亲和素磁珠结合。之后在蛋白质-RNA结合缓冲液中平衡RNA结合的磁珠，再加入蛋白裂解液。随后添加适当的缓冲液、涡旋振荡，并在磁力架上分离，洗涤磁珠。最后样品可通过非变性的生物素洗脱缓冲液或 SDS-PAGE上样缓冲液洗脱，用于下游分析。
此试剂盒的特点在于：
• 直接：直接利用末端标记的RNA捕获核糖核蛋白复合物;不需要使用抗体进行pull-down
• 简单：RBP富集过程无需离心;步骤简化，在RNA标记反应后手工操作不到3小时
• 灵活：使用不同长度的体外转录RNA或合成RNA进行标记;可成功富集内源、过表达和体外翻译的裂解液中的蛋白
• 特异：磁珠背景低;未处理的RNA或突变RNA不会明显富集特定的RBP
• 经济：比单独购买合成的末端标记RNA、磁珠和试剂更为经济
• 完整：包含标记和富集组分及分析缓冲液;阳性对照RNA、阴性对照RNA和RBP抗体也包含在内
此试剂盒包含的试剂足够20次RNA标记反应和20次蛋白质-RNA pull-down分析使用。
