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【求助】T4 DNA Ligase 连接时间

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-8-27 10:24    作者: yhz1973    来源: 分析测试百科网

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【求助】T4 DNA Ligase 连接时间
我用T4 DNA 连接酶将4Kb多的片段连接在T载体上，挑十几个样最后酶切只有一个是正确的，之前做过比这个小一半的片段，转化效率很高，请大家帮忙指导一下，为什么假阳性这么多，是不是连接时间过长（我每次都是晚上做上，第二天晚上做转化，差不多连一整天）
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最新回复

  • yjf1026 (2014-8-27 10:24:59)

    我觉得你应该继续往下做的你的实验，而不是纠结这个。

  • ladyhuahua (2014-8-27 10:25:17)

    楼上正解。T载体确实会产生很多假阳性，纠结于此于事无补。

  • bhka (2014-8-27 10:25:50)

    不知你用的是哪个公司的T载体。大约2005年左右的时候用TAKARA的T载体，连接效率很高，基本上做转化我只挑3个斑就3个全中。后来到了2010年左右的时候TAKARA的T载体连接效率就很低了，差不多低到10个只能中1个。让我很失望。

  • summerxx (2014-8-27 10:26:07)

    长片段酶连效率会低于短片的，适当延长酶连时间。

  • leifengta (2014-8-27 10:27:00)

    4℃连接过夜，想效果更好再16℃连2-4h。

  • orangecake (2014-8-27 10:27:20)


    我用16度连接过夜，也还行

  • yhz1973 (2014-8-27 10:27:51)

    QUOTE:

    原帖由 yjf1026 于 2014-8-27 10:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    我觉得你应该继续往下做的你的实验，而不是纠结这个。


    我当然是没有耽误后续的实验了，只是出现问题总要分析一下原因吧

  • yhz1973 (2014-8-27 10:28:16)

    QUOTE:

    原帖由 bhka 于 2014-8-27 10:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    不知你用的是哪个公司的T载体。大约2005年左右的时候用TAKARA的T载体，连接效率很高，基本上做转化我只挑3个斑就3个全中。后来到了2010年左右的时候TAKARA的T载体连接效率就很低了，差不多低到10个只能中1个。让我很失望。 ...
    我用的是Promega的pGEM-T easy vector，小片段挺好的，大片段就很不好用了

  • yhz1973 (2014-8-27 10:28:33)

    QUOTE:

    原帖由 summerxx 于 2014-8-27 10:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    长片段酶连效率会低于短片的，适当延长酶连时间。
    我连的时间挺长了，都快一整天了

  • redbutterfly (2014-8-27 10:28:57)

    应该恭喜你，我载体一直构建不出来。

  • redbutterfly (2014-8-27 10:29:13)


    我的不是T载体构建，就是常规的酶切，连接，一直没成功。目前还没找到原因。

  • yhz1973 (2014-8-27 10:29:37)

    QUOTE:

    原帖由 redbutterfly 于 2014-8-27 10:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    我的不是T载体构建，就是常规的酶切，连接，一直没成功。目前还没找到原因。
    你是用什么酶做的连接

  • baidukk (2014-8-27 10:29:57)


    T载体本来也就不到5K的大小吧，连4K的片段进去很难的，所以效率低是很正常的，这不算是什么问题吧~

  • dragonkilly (2014-8-27 10:30:50)

    QUOTE:

    原帖由 yhz1973 于 2014-8-27 10:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')


    你是用什么酶做的连接
    确实是这样，我这几天连的2k多的片段就挺好的，4k多的就不行了，不知道有什么适合长片段的载体

  • dragonkilly (2014-8-27 10:31:45)

    NEB T4连接酶。今天测序结果刚回来，貌似不理想，还再DNAman中。。。

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    我用的也是这个酶，如果你的测序结果不理想的话应该是PCR的原因吧，可以试试高保真酶
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