【讨论帖】PCR问题交流

最新回复

• baidukk (2014-9-25 18:00:46)

  不知群里是否有做多重PCR的兄弟姐妹，在这里想请教一下下面的多重PCR程序是如何设计出来的，需要依据什么来设计？请高人指点。
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• 2541 (2014-9-25 18:01:03)

  我想请教一下聚合酶延伸效率的问题。一般的聚合酶的延伸效率是多少？在做pcr的时候，为什么20s就可以扩增出2K的片段？很迷惑。

• redbutterfly (2014-9-25 18:01:20)

  
  如何pcr新基因？

• @STAR@ (2014-9-25 18:01:58)

  QUOTE:

  原帖由 2541 于 2014-9-25 18:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我想请教一下聚合酶延伸效率的问题。一般的聚合酶的延伸效率是多少？在做pcr的时候，为什么20s就可以扩增出2K的片段？很迷惑。

  一般的来讲，Taq聚合酶的延伸速度是1000bp/min
  至于你说在20s延伸出2000的片段这个有可能，但并不常见
  一般在非特异扩增或者以逆转录产物做模板的时候会出现。
  

• @STAR@ (2014-9-25 18:03:54)

  QUOTE:

  原帖由 redbutterfly 于 2014-9-25 18:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  如何pcr新基因？

  你是指吊取未知基因是吗，这样的话，一般是根据这个未知基因在不同物种间的同源性在保守区设计同源简并引物进行PCR如果要获得全长基因的话还可能要在两端进行RACE扩增获得5'端和3'端非编码序列。

• whitesheep (2014-9-25 18:04:13)

  我想请教一下：
  我的目的片段是DNA长度5700多，CDNA长度1900，起初想从DNA中扩增目的条带，但是一直没有扩增出来，因此我提取RNA，合成CDNA第一链，这回有条带了，但是条带很弱，我的PCR条件：
  1.  94°  3min
  2.  94°  30sec
  3.  51° 1min
       -0.1°每个循环
  5.  72° 3min
  6.   2 ~5 32个循环
  7.   72° 10min
  我想进行胶回收然后，然后克隆该基因，不知道该如何优化a

• 2541 (2014-9-25 18:04:56)

  先谢谢楼主，不过我扩出来的是目的条带，没有非特异条带。我正常情况下都按这个效率进行PCR的。

• @STAR@ (2014-9-25 18:05:23)

  我的目的片段是DNA长度5700多，CDNA长度1900，起初想从DNA中扩增目的条带，但是一直没有扩增出来，因此我提取RNA，合成CDNA第一链，这回有条带了，但是条带很弱，我的PCR条件：
  1.  94°  3min
  2. ...
  
  ================================
  
  CDNA1900?另外你是用的长距离taq酶么？

• 2541 (2014-9-25 18:05:47)

  长的和普通的都用了！

• 2541 (2014-9-25 18:06:03)

  谢谢您的回答！还有就是我现在重新P，原来的条件竟然没有目的带了！
  

• 2541 (2014-9-25 18:06:27)

  CDNA长度1900多！

• wiwi (2014-9-25 18:06:46)

  1000bp/min，保险起见，可适当延长时间

• @STAR@ (2014-9-25 18:07:06)

  
  如果你是以逆转录产物做模板扩增cDNA的话，你的条件要改改，你的延伸时间2分钟足够，退火温度放到50度就可以
  那个-0.1度那步不要，没啥用，你一旦扩增出目的条带，把它回收了之后，以产物做模板提高退火温度再P一次

• TNT (2014-9-25 18:07:40)

  
  Taq酶1kb一分钟吧

• dodoit (2014-9-25 18:08:06)

  
  请楼主帮忙回答一下这个问题，谢谢了
  cuturl('http://ask.bbioo.com/ask/show-1922.html')

• ENA (2014-9-25 18:08:22)

  
  各位  我在PCR时  没加模板 可总是有带，我一共有20多对不同的引物，不加模板，几乎都有带，不知道为什么！我的引物是分装的，而且 基本排除了污染。请问，这种情况，有无道理？

• flower@@ (2014-9-25 18:08:40)

  
  我也有个问题想请教，昨天做PCR，20微升体系，目的片段一个是300bp左右，一个是2300bp（、我当时不知道），我选的延伸时间是1min，结果做完电泳后发现后一个目的片段有两条很亮的条带，一个大约就是2000多，另一个在200~300之间，我用的酶是Pyrobest，高手请帮忙解释一下为什么会出现这样的两条带？
  

• yhz1973 (2014-9-25 18:08:59)

  
  请问一下，为何我的pcr产物检测时条带很浅，我已经设置了退火温度梯度，模板也是才提的，最近跑出的pcr条带一直很浅，请大家帮帮忙

• chuntian1983 (2014-9-25 18:09:31)

  各位  我在PCR时  没加模板 可总是有带，我一共有20多对不同的引物，不加模板，几乎都有带，不知道为什么！我的引物是分装的，而且 基本排除了污染。请问，这种情况，有无道理？
  
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  我在做荧光定量PCR的时候也遇到过这种问题 后来觉得可能是由于荧光定量这种东西过于敏感 一点点模板就可能p出东西来 再有一点就是 可以试试把枪酒精消毒 再放到紫外下照 全面消毒 或者用带滤膜的枪头 有时候 枪和环境中一些残留的东西也会作为模板出现

• wood533 (2014-9-25 18:09:53)

  
  为什么我做单管PCR时可以P出来，而做96孔板却P不出来了呢？想了半天想不出原因，给指点下哪些方面应该特别注意。