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【求助】双荧光素酶报告法验证miRNA靶基因
各路同道英雄前辈，目前我要做双荧光素酶报告法验证靶基因，有几个疑问，请大家给予帮助：【求助】双荧光素酶报告法验证miRNA靶基因
1、pGL3-control 载体的荧光素酶载体下游基本没有可以双酶切的单克隆位点，Xba1比较常见，准备用单酶切，但我的mRNA序列里竟然有几处Xba1的酶切序列，请指点~~
2、看有些文献里得到3'UTR是通过提取DNA然后扩增出来的，我想用NCBI中找到的mRNA 3’UTR然后设计引物反转录后pcr扩增双链DNA然后构建到载体上行不？
3、有一个靶基因mRNA的3'UTR全长（无poly A尾）2800对bp，太长了，能不能不用全长克隆到荧光素酶报告载体上？
4、还有共转染miRNA，要合成miRNA。我想知道是合成miRNA成熟体序列及其互补链序列，然后复性形成双链RNA然后直接用脂质体包裹转染吗？如果那样，转染到细胞内会不会被降解呢？
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最新回复
49888 (2015-1-29 17:00:05)
第二条，应该是可以
第三条，最好不要，因为你不能确定结合的靶位点到底在什么位置，而且RISC可能需要整个UTR来作用，当然你也可以试试
第四个我就不知道了
楼主能不能把你查到的相关文献发给我一份jiangyuan2012@163.com
谢谢
leifengta (2015-1-29 17:00:34)
2、可以做RT-pcr来扩UTR。
3、不必扩全长utr，在你 预测靶位点 上下游各200bp设计引物扩增就可以。
4、mimics 是单链。有专用的转染试剂盒。不用考虑降解的问题。一般效用可达72小时，足够发挥效用了
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