【求助】引物合成引物有两个Tm值，如何确定PCR的退火温度？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2015-7-03 10:50 作者: biabiade 来源: 分析测试百科网

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【求助】引物合成引物有两个Tm值，如何确定PCR的退火温度？

新手最近PCR。引物是参考BLOOD合成，引物合成有两个Tm值，如64.07度（0.05M Na+）；73.08度（1M Na+），如何据此确定退火温度？另外，我的上游引物GC含量达71%（因为觉得BLOOD是权威杂志，之前未认真计算），不知有没有PCR成功的可能性？出了神马问题？敬请高手指点。（5个基因光退火温度摸了快两个月，还没结果，着急啊）
有木有，有木有！

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biabiade (2015-7-03 10:52:30)

sense, CCACCAGGCACTCGGGGCCTA;antisense, GGAGTAATAAGGAGGCTGGCG;
sense, AAAATGCCAGCTGATATAATGGAG; antisense, GGTCTGTGCTCAGCGCAGCCGTCA;
Sense:5’-CGCGGATCCGTGACCTGTGATGACTACTAC-3’.Antisense:5’-CCGGAATTCACATTCGGGGCCCATCC-3’
Sense:5’-CCGCCTTTGTGCTTCTGTT-3’.Antisense:5’-CCGGAATTCACATTCGGGGCCCATCC-3’
Sense:5’-AATGGTGGCATCTGTGTTGA-3’.Antisense:5’-GCGATACCCGTTGATCTCAT-3’
高手帮我看一下，我前面三对引物分别用60、62、63度摸过，后两对用55、56、57度摸过，P的不理想，二聚体多，请各位大侠帮帮我，我P不出来，需要重新合成引物吗？期待中。
vcve (2015-7-03 10:52:48)

二聚体多的话可以调下引物及模板浓度试试呢
ldh (2015-7-03 10:53:06)

以第一对引物为例：
主要的问题是上游引物有稳定的loop，需要提高退火温度，引物只有打开二级结构后才能有效与模板结合。但是提高退火温度也会降低引物与模板结合的效率，这样就需要同时增加引物的量。
摸索退火温度是要参考Tm，不确定各个公司引物合成单上的计算方法，你说的两种Tm是不同盐离子浓度条件下计算的：0.05M Na是指一般PCR体系中的盐离子浓度，因为大多数Taq PCR体系含50mM KCl。
用oligo分析会给出3种Tm，大多数情况下可以参考Td，这个方法考虑了3末端碱基。
因此，建议在65-72度范围内做梯度，引物浓度各0.4uM

[ 本帖最后由 ldh 于 2015-7-3 10:55 编辑 ]

53962079.jpg
gmjghh (2015-7-03 10:55:32)

这么高的退火温度，就不需要延伸步骤了，退火时间按照1kb/min计算。
biabiade (2015-7-03 10:55:50)

当初引用的BLOOD上的引物序列，这么高的退火温度能PCR出目的基因吗，需要重新合成引物吗？
菜鸟期待中。
cj_mondy (2015-7-03 10:56:07)

高退火温度也很正常，多试试PCR条件。实验还是需要实践的。
biabiade (2015-7-03 10:58:30)

今天终于P出来一对目的基因，退火温度65度。zcldfoo1真是高手，令人崇拜。
希望我能很快摸出其他4对基因的条件。
whitesheep (2015-7-03 10:58:49)

今天终于P出来一对目的基因，退火温度65度。zcldfoo1真是高手，令人崇拜。
希望我能很快摸出其他4对基因的条件。