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【求助】求助western高人，荧光淬灭都快把我逼疯了
对于western显色荧光淬灭的解释都是蛋白浓度、一抗或者二抗浓度过高的缘故。我也曾试过我二抗浓度降到推荐的最低，可是还是不行。下面我把我的具体情况给大家说一下，希望同仁们多多帮助，不吝赐教！【求助】求助western高人，荧光淬灭都快把我逼疯了
我是提取细胞裂解液上样，最初的时候因为要检测的蛋白表达量低所以上样60ug，用的的PIERCE的荧光显色，开始1：2000稀释二抗，显色结果很好，荧光也非常亮，非常持久，stripping 3次以后还是能得到持久的荧光显色。但是不知道从什么时候开始，莫明的就出现了荧光很快淬灭的现象。就是加上显色底物以后，荧光就迟也在2分钟内消失。我在版上和PIERCE的说明书上仔细的学习过了，都是说二抗的浓度高，后来我就把二抗降到说明书推荐的1：5000,在暗室中观察加上显色底物荧光非常暗，但还是会很快消失。后来我又把上样时的蛋白总量减半但还是不能解决问题。
我的问题有这么几个：
1. 以前1：2000的二抗浓度，荧光有量又持久，而现在二抗降的再低都不行，这是为什么呢？
2. 荧光消失以后再补加显色底物，荧光亮一下，消失的更快，而且把底片在膜上一压，荧光就马上淬灭，这又是为什么呢？
3. 我还发现如果一张膜杂一个抗体时淬灭，stripping后杂别的抗体都会淬灭
现在都快疯了，和以前做实验的步骤方法都没有差别，但现在一曝光就淬灭，恳求大家帮帮忙啊！！
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【求助】求助western高人，荧光淬灭都快把我逼疯了
最新回复
u76mp (2013-10-06 15:14:36)
荧光的快速淬灭应该不是你上样量和二抗的问题。
很多国产二抗效价根本达不到1：5000的。此外，如果60 ug的上样量，ECL就出问题了，我想PIERCE的质量也太差了。
因为没用过PIERCE的ECL试剂盒，所以只能根据我的经验来猜测几种可能：
1. ECL试剂盒应该有A液和B液。A液是发光物，B液是0.1％的过氧化氢。所以，你回忆一下，在取A液和B液的时候会不会忘了换枪头，导致AB液之间有污染，容易造成ECL效果减弱。
2. A液要严格低温避光保存，会不会在亮光的房间里打开过A液。
3. 仔细检查你用到的缓冲液，如TBST或者STRIPPING buffer，看看PH是不是有明显改变。
good luck
如果找到原因了，也请发上来，或许对其他人会有帮助
qqshepherd (2013-10-06 15:15:15)
QUOTE:
我们实验室A液和B液都是一起用的，其他人做也没有淬灭啊我做60ug的蛋白量，开始没有淬灭，后来做得多了，就出现淬灭的现象了
langlang (2013-10-06 15:16:52)
kuaizige (2013-10-06 15:17:17)
淬灭后你曝光X片上有条带吗？我有时候加显色底物后也看不到荧光，压片时间延长也有条带啊
wood533 (2013-10-06 15:17:41)
qqshepherd (2013-10-06 15:18:44)
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淬灭以后就曝不出带了
以前试过压片时间延长，结果是第一张底片上能有几条没有淬灭完全的条带，在曝第二张的时候就是一片空白了
qqshepherd (2013-10-06 15:19:22)
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请问是温度高淬灭得快吗？
DONT (2013-10-06 15:19:53)
======
是的
DONT (2013-10-06 15:20:29)
请问楼主发现是什么原因了吗，我也遇到这个问题了，加了AB液后荧光很强，于是先压了20秒，后来又压了1分钟、 30秒的，结果出来居然只有第一次的条带，再看也不见荧光了，是什么原因呢，我一抗用1：250（因为前面1：500没做出来）二抗用1：2000
DONT (2013-10-06 15:20:56)
我也遇到过这种问题，淬灭很快，即使荧光很暗，淬灭也很快，持续不了1分钟，我也不知道是什么原因
greenbee (2013-10-06 15:21:21)
我发两个荧光淬灭的小教训，供大家参考，一次，我在NC膜上加入发光试剂，在肉眼清晰可见发光条带，可是往保鲜膜上一放，其中的一条发光带马上淬灭。不到一分钟，另外一条也淬灭了。事后，我考虑是保鲜膜的原因，所以，在做实验的时候，大家一定不要怕麻烦，把保鲜膜反复清洗，洗干净。
另外一次，发光带相当亮，我连续曝了三张片大约快有十来分钟了，还是相当亮。我曝完片子的时候，拿NC膜的时候，我用镊子碰了一下发光带，马上荧光淬灭，最后，我再用发光液反应的时候，荧光再也不出现了。所以，大家在操作的时候，千万不要用镊子来碰这个敏感的部位。
具体的原因我也想不清楚。也许从发光反应的本质还能得到一点启发吧。
plaa (2013-10-06 15:21:42)
我也遇到过，后来证实是ECL过期了，已经不稳定了。但那时ECL的A'B也别人用也是荧光很快淬灭的。换了一种就好了。
fox_79 (2013-10-06 15:23:00)
我用ECL效果很好，不会很快消失的 ，但是操作要快点好
ladyhuahua (2013-10-06 15:23:46)
我最近也遇到这个问题，实在是琢磨不透。
以前做过N次，基本没有遇到过。最近能看到明显的荧光，但很快淬灭，来不及压片就没有荧光了。
我尝试过换底物，换不同公司的底物，甚至用新的，不行。说明不是底物的问题。
降低二抗的浓度和孵育时间，仍然不行。
换保鲜膜，也不能解决问题。
其实方法都是和以前一样的啊，实在不明白到底问题出在哪里。
哪位要是有类似问题，欢迎讨论共享。
wood533 (2013-10-06 15:24:18)
如果不是发光剂的问题，操作是否在暗室操作，在明光下加A，B液，淬灭可能快了点
淬灭快，还是可能二抗和发光剂的问题
建议在暗室操作，EP管里或干净的塑料膜上加一点1：2000的二抗，再加入混合均匀的发光剂，有无荧光淬灭现象，如果有，还是二抗或发光剂的问题，再换发光剂或二抗试下
GOOD LUCK
131415 (2013-10-06 15:24:35)
荧光淬灭问题的解决异常简单,肯定有一种试剂出问题.
建议把所有试剂扔掉,重新配制.
Ao7 (2013-10-06 15:24:56)
有时候，红灯也有影响
c86v (2013-10-06 15:34:02)
很多情况都会导致荧光淬灭，可能每个人的情况并不相同。
【1】用保鲜膜包好的带荧光的膜，千万不要放到金属表面，碰到金属表面，荧光会迅速的淬灭。因为有些桌子是金属的，所以放到上面会导致荧光迅速淬灭。这是亲身经历的。有些战友提到用镊子碰到膜会导致荧光淬灭，可能是因为镊子是金属的缘故。
【2】不注意的时候，把ECL的A和B混合了，以后再用，也会导致荧光淬灭。各溶液使用后，请盖紧瓶盖，以防失效。特别是B液，含有氧化剂，比较容易被还原而失效。
【3】荧光可能对一些物质敏感，导致荧光淬灭。所以，尽量使和荧光接触的物品都是干净的。我以前都是用保鲜包裹膜，然后曝光，但是保鲜膜太薄，容易卷起来，我就用较厚的塑料袋，但是发现荧光一接触塑料袋就迅速淬灭，我估计可能是因为后塑料袋上不干净，有些导致淬灭的物质。后来继续应用保鲜膜，就没有出现类似情况了。
【4】荧光淬灭和蛋白抗体等也有原因。我以前就碰到过，我的是5个条带，发生淬灭的时候，有快有慢，不是5个条带一起淬灭。尽管后来都淬灭了。所以，估计和蛋白抗体等也有关系，但可能并不是主要的原因。
lxh031 (2013-10-06 15:34:21)
八成儿是你的ECL出问题了，换个新的试试嘛！不用买，找同学蹭着用一次就行啊
bring (2013-10-06 15:34:49)
关于能看到荧光淬灭快的问题，我也碰到过多次，根据我自己的经验建议如下解决：
首先考虑底物的问题，这是最有可能发生的。就算这个底物上次使用没有问题，别人用也没有问题。也首选考虑换底物。另外需要注意的是已经使用过不好的底物的膜建议换底物也没有用。最好重新跑胶转膜。以下两条均在底物确认多次无问题的情况下实施。
然后考虑二抗的问题。重新换二抗或者稀释二抗的浓度。上样量减少。
对于局部荧光淬灭很有可能与您的操作如不干净的保鲜膜或者金属镊子碰到相关。
总之，遇到相关问题要积极探索，周全想到每一个环节。祝大家实验顺利。
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