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【求助】170KD的蛋白怎么弄？
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我都郁闷死了。
我做了好些次170KD的蛋白western-blot了，修改很多参数，还是不出结果。
我用6%的分离胶、3.5%的stacking gel。 电泳100V 15分钟，后改为140V，50分钟。然后用低温低电压转膜（放在冰盒中，90mA12小时转膜），5%脱脂奶封闭1个半小时。1抗1：200（推荐1：200----1：1000 Santa Cruz）二抗抗鼠的1：2000。结果什么都没有出来，我觉得我已经尽最大努力了。
求助大家给点意见。
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最新回复
kewanqi2011 (2014-3-31 16:47:51)
附注：我的Marker 条带特别散，是跟 胶稀有关系么？？
我的样品是人脑组织匀浆后所得，已经用了多次，反复冻融了多次。
我在转膜过程中，由于换冰块，不小心碰到转膜仪，中断转膜一次。
我用丽春红染色，感觉看到的就是蛋白了，可是什么都没有。我明天把照片传上来。
如果需要，我把所有实验步骤详细写下来。
如果能有人指导，十分感谢十分感谢！！！！！
bling (2014-3-31 16:48:08)
上层胶有点稀。其实你就都用常用的积层胶就行，因为它的pH跟下面不一样的。
bling (2014-3-31 16:48:26)
daod (2014-3-31 16:48:38)
我们用北京六一厂的双垂直电泳槽 电压可以160V至溴酚蓝出胶
4％上层胶，下层胶平分为两层，上层6％或8%,下层12％
可用预染Marker指示条带位置及电转效果
电转用不含SDS和甲醇的电转液，冰浴 0.32A 恒流电转，6％或8％部分2h，12％部分1h
1抗可以试试1：500 4度过夜
最好同时作个阳性对照，如顺便把Actin杂出来，看看是不是TBST什么的有问题
总蛋白上了多少 这种蛋白在脑组织中的表达量如何
yueban-1147 (2014-3-31 16:48:58)
1.170 kd左右的蛋白我们一直在做呵呵,既然marker跑的不理想我想首先还是要先解决电泳问题;楼主可参考一下我们的条件:我们用的北京六一的仪器,用80V恒压跑stacking gel (浓度为5%),等30 min后进入resolving gel (浓度为8%)后换成120 V恒压跑大约1个多小时,这时候溴酚蓝基本上已经到底,而根据预染marker(购自MBI)170 kd的蛋白大概在resolving gel的上1/3,这时就可以结束电泳了.
楼主用的140 v恒压我们当时也用过,50分钟内倒是可以结束电泳,但是marker分离的效果不好,另外建议你还是跑5%的上层胶,8%的分离胶,我们用的一点问题都没有,而且小弟感觉如果胶太稀了,后面的转膜不太好操作呵呵(小弟手拙,就算是8%的胶也经常被我弄破)
2.转膜这一步我们用的仍然是六一的,恒流200-300 mA转2-3小时,根据小弟实验室的经验,转膜开始时电压大概在140 v左右,2小时后可能会降到90-100v,如果2小时后低于90,我们通常会延长时间至3小时以确保170kd的蛋白被转到膜上去. 小弟觉得楼主的90mA过夜似乎有点过了,印象中过夜的话用40mA就足够了.
3.block:现在是夏季,室温BLOCK 1小时也足够了.
4. 一抗,二抗的问题先不要着急,建议楼主先做个ACTIN之类的内参看看 结果,如果内参没出来,在确保你的标本没有出问题的情况下再去一步步排查每一个步骤和过程吧.另外想确认一下,你用的2抗是抗鼠的,那一抗呢?这一点最基本的可不要出错哦,如果一抗是兔抗人,那你选抗鼠的2抗肯定错了,呵呵,也许是我太小看楼主了,仅仅是提个醒,望见谅.
5.剩下的步骤我想就不用多说了,祝你好运.
kewanqi2011 (2014-3-31 16:49:26)
kewanqi2011 (2014-3-31 16:49:44)
kewanqi2011 (2014-3-31 16:51:34)
谢谢。
kewanqi2011 (2014-3-31 16:51:59)
我写一下自己的实验记录：
1、洗净玻璃板，擦干，安好。
2、配置6%分离胶并灌胶，后用水压平。
3、倒掉水，并用滤纸吸干后灌3.5%积层胶后插入梳子。
4、充分凝固后，准备放入running buffer和电泳槽中。
5、80微升+20微升5*上样buffer，100度加热5分钟。
6、上样。
7、电泳， 100V13分钟后调为140V60分钟。
8、轻轻取下胶，转膜。90毫安，12小时，放入冰盒中，低温湿电转。
9、轻轻取出NC膜，从63KD处用剪刀剪开，分别在右下角做一标记，5%脱脂奶封闭1个半小时。
10、丽春红染色，照相。
11：配置1抗， 1：200 4毫升。
内参： 1：800 5毫升。
12：上半部分膜与一抗孵育，下半部分膜与内参结合。封于自封袋中，4度过夜。
13：TBST洗脱 8分钟*3次。
14、配置二抗，1：2000。分别加入对应二抗。
15、 二抗孵育1小时。
16、TBST洗脱， 8分钟*3次。
17、用普利来ECL发光液体，A、B液各取2毫升，混匀，滴在膜上，
.....................暗室曝片。
18、顺便我把转膜后的NC膜发上来，请大家给与指导。
买的东西快用光了，可是老不出来条带，我疯了。
kewanqi2011 (2014-3-31 16:52:34)
29350057.snap.jpg
kewanqi2011 (2014-3-31 16:53:16)
顺便说一下稀胶的处理： 我的胶特别稀，如果手拙的话，容易弄破，我这样弄的，我把玻璃板打开，然后把带胶的那张板，盖在滤纸上面，放在trans buffer中，用那个刮得东西慢慢刮开，在液体中不会破的。
hold住 (2014-3-31 16:53:40)
如果你传上来的图上那条模糊的条带是你的marker,而且你认为marker没有坏掉，那么你这样的电泳转膜后是不大可能做出条带来的。因为你的目的蛋白，表达含量本来就不多，目的蛋白被分散在很宽的区域，而不能在跑胶的时候浓缩，那么单位面积上结合的一抗二抗就会比较少，就会无法显影了。
湿转膜25-30 mA 12h就够了——170kD的蛋白western我做过。
做好胶，要保证你的浓缩胶、分离胶缓冲液的pH都要精确。浓缩胶、分离胶分别凝30分钟，而不是10分钟凝了就马上跑胶。还有，分离胶用7.5%的就可以了，没必要弄得太稀。再好好看看跑蛋白电泳的教科书，精确地按规定做。你的胶跑好了。也许Western就出来了。
kewanqi2011 (2014-3-31 16:54:04)
你说湿转膜25-30 mA 12h就够了。是mA么？是不是应该是电压。我看bio-rad说明书，说应该90mA过夜，或者400mA2个小时。
hold住 (2014-3-31 16:54:30)
summerxx (2014-3-31 16:54:48)
感谢楼主随时反馈信息，使讨论得以继续深入，希望继续努力，找到可能的问题及解决方法后将分析贴上来，我们会根据[公告]为您加上一分！
欢迎您常来蛋白版~~~
kewanqi2011 (2014-3-31 16:55:11)
mamamiya (2014-3-31 16:55:28)
总蛋白定量了吗？
H2O (2014-3-31 16:55:53)
30mA过夜转，或者300mA转90分钟试试，我做过250kD的蛋白，效果还是不错的。
还有样品获取时楼主说是反复冻融取得，如果是为了获取目的蛋白似乎这样不太妥当，因为反复冻融会导致蛋白的急剧降解，建议匀浆后纱布过滤后使用裂解液的方法获得目的蛋白。
kewanqi2011 (2014-3-31 16:56:16)
经过我反复卓越的斗争，我终于把试验条件摸了个初概，第一次出结果，和大家分享我的结果。
1、我这次蛋白上样量比较高（因为我的目的蛋白含量低，所以我这次非常注意，增加蛋白上样量）。93微克。
2、然后电泳，在这次电泳中，我非常注意，低温电泳，我把电泳仪放在洗脸盆中，盆里放了冰块。80V5分钟，100V8分钟，120V77分钟。共约90分钟（marker 条带跑开，清晰条带看到即可）。（我认为，Marker如果散了，我的目的蛋白也可能散，所以不必跑太久，有好几次，我让我的181条带跑到中间，然后就特散）。
3、然后我切下一小条胶，考马斯亮蓝染色，看到很多漂亮的条带。
4、转膜，400mA，3小时。低温状态下。
5。考马斯亮蓝染胶，（仍然看到有条带，我本来要放弃，我同学阻止我，让我继续做）。
结果分析：我的两张膜，其中靠近黑面的那张膜转的比较好，而另外一张就很差了，应该增加冷却装置。我认为。我的脸盆中冰块过少。
结果分析2：我的目的蛋白显色并不在相应蛋白分子标准内。我怀疑是降解了，我的蛋白是多个亚基组成。这样影响我的结果分析么？？
请高手指点一二！！！
kewanqi2011 (2014-3-31 16:56:39)
亚基分解，有什么办法阻止么？或者说，不阻止能不能分析呢？
谢谢高手指点
【求助】170KD的蛋白怎么弄？