【讨论帖】正在养或已经养过HUVEC的请进

最新回复

• DCS (2015-7-09 10:06:56)

  
  支持！
  我刚刚开始养HUVEC，重重问题重重山，重重山重重雾，一些携手拨开迷雾见日出吧！

• eor (2015-7-09 10:13:38)

  
  我一直培养HUVEC，但生长很慢，不知你们培养的情况如何。我的培养基中的ECGS为55UG/ML。这样的量还行吧？

• jude (2015-7-09 10:14:01)

  QUOTE:

  原帖由 eor 于 2015-7-9 10:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我一直培养HUVEC，但生长很慢，不知你们培养的情况如何。我的培养基中的ECGS为55UG/ML。这样的量还行吧？

  因为没有用过ECGS进行培养，所以不太清楚使用量，可以请青衫兄来解答一下。今天晚上给HUVEC传代，进行种植。不顺。在加胰酶前用培养基冲洗以后，发现细胞突然变圆。可能与培养基，以及细胞的量（今天70～80％）不足，还有冲洗力度有关。分析最大可能细胞量少，冲洗力量过大有关。

• veiwu (2015-7-09 10:14:54)

  我也有几点经验，请方家指正：
  由于M199中含有的VC不多，而内皮细胞最易遭到氧化损伤，故在配置2~4周后的M199中应该添加VC，建议浓度10uM；
  务必使用名牌血清，如Hyclone的标准胎牛血清；
  为了控制平滑肌细胞及成纤维细胞的生长，可以适量添加肝素，如5u/ml；
  如果没有使用胶原包被的瓶子，可使用一次性塑料培养瓶（Corning），内皮细胞通常能够很好地在新瓶子上贴壁，一个瓶子一般至少可以传3代。但是随着消化次数增加，细胞贴壁明显受到影响；

• jude (2015-7-09 10:15:17)

  我想问下，复苏HUVEC离心时，离心的速度与时间怎样的？实验室的老师建议我1000rpm 15~20分钟，文献上报道大多在5分钟左右。
  可我上次复苏离心5分钟，细胞好像没下来都丢了。

• baidukk (2015-7-09 10:15:33)

  
  一般离心10分钟是比较保险的，这样细胞团比较紧密，换液时不易破坏沉淀，也能将上清吸得比较干净。继续延长时间似乎没有好处。

• xyw5 (2015-7-09 10:16:43)

  QUOTE:

  原帖由 jude 于 2015-7-9 10:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我想问下，复苏HUVEC离心时，离心的速度与时间怎样的？实验室的老师建议我1000rpm 15~20分钟，文献上报道大多在5分钟左右。
  可我上次复苏离心5分钟，细胞好像没下来都丢了。 ...

  如果你离心之后肉眼没有看到细胞沉淀，那么说明离心程度不够（如果冻存时细胞很多的话）。复苏后细胞的生长状态与很多因素有关。如果一开始冻存没有做好，那么复苏后 细胞生长也很差劲。再就是离心时注意时间的计算，待转速达到所需时，开始记时。

• eor (2015-7-09 10:45:39)

  
  谢谢楼上两位的回复，我想下午复苏一瓶看看，希望自己好运气！

• mickeylin (2015-7-09 10:53:38)

  我一直培养HUVEC，但生长很慢，不知你们培养的情况如何。我的培养基中的ECGS为55UG/ML。这样的量还行吧？
  我觉得你的ECGS浓度有些低,我用的是SIGMA公司的ECGS,所用浓度为75UG/ML,另外血清也很重要,以前用的国产血清,贴壁及生长不大好,换用HYCLONE的胎牛血清,细胞生长状态还好!希望你能顺利!

• NBA (2015-7-09 11:05:46)

  QUOTE:

  原帖由 jude 于 2015-7-9 10:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  因为没有用过ECGS进行培养，所以不太清楚使用量，可以请青衫兄来解答一下。今天晚上给HUVEC传代，进行种植。不顺。在加胰酶前用培养基冲洗以后，发现细胞突然变圆。可能与培养基，以及细胞的量（今天70～80％）不足，还有冲洗力度有关。 ...

  我也没有用过ECGS，都是用的是ECGF，不过两个的主要成分差不多的。呵呵！就是纯度的问题了。帮常子兄弟查了查文献，看样子都是用的50ng/L（也就是50ug/ml），也有用高一些的，100ug/ml的，文献都附在下面。 Tongue
  另外，你做实验的可以看情况，要是细胞长得不好就多加点生长因子吧。不过，最好是用好点的胎牛血清。

• greenbee (2015-7-09 11:06:14)

  
  我用的是SIGMA公司的ECGS，HYCLONE的特级胎牛血清，1640培养基，每三天换液一次，细胞培养了一个月仍不足80%，25cm2的瓶子，烦极了，老板要我快点做试验，但细胞数不够。什么方法可使细胞生长快些？

• greenbee (2015-7-09 11:07:57)

  我复苏HUVEC不离心，加入约8倍的培养基在瓶子中，然后再把已解冻的细胞液加进去，让其贴壁过夜，次日换走含DMSO的培养液就可。

• NBA (2015-7-09 11:18:33)

  QUOTE:

  原帖由 greenbee 于 2015-7-9 11:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我用的是SIGMA公司的ECGS，HYCLONE的特级胎牛血清，1640培养基，每三天换液一次，细胞培养了一个月仍不足80%，25cm2的瓶子，烦极了，老板要我快点做试验，但细胞数不够。什么方法可使细胞生长快些？ ...

  
  在没加ECGF和肝素的前提下，使用同样的奥地利标准血清，我的感觉是DMEM/F 12比1640的效果要好一些，你可以试试。F12较适合原代培养。对了，如果用的是细胞株，最好用与原先一样的培养基。

• NBA (2015-7-09 11:18:52)

  我想问下，复苏HUVEC离心时，离心的速度与时间怎样的？实验室的老师建议我1000rpm 15~20分钟，文献上报道大多在5分钟左右。
  可我上次复苏离心5分钟，细胞好像没下来都丢了。
  
  ==============================================================================================================
  
  一般的离心力都是用g的多少倍来计算的，它与离心机的臂长和转速有关。而离心效果的好坏除了与培养的细胞种类有关外，与离心力有很大的关系。因为实际上使用的离心机，其硬件有差别，因此，参考别人的指点的同时，最好自己摸索一下，到底什么样的转数和时间适合你用的离心机和你要离心的细胞。一点个人经验，呵呵，献丑。

• NBA (2015-7-09 11:20:25)

  
  我用的那个离心机可以考虑退休了。转速早就不准了，我现在都是离心后肉眼观察，摸索转速。
  另外，关于原代培养时的离心问题。今天又做了一次原代培养，再一次感觉到原代培养步骤复杂，费时。突然考虑到能不能收集到细胞后，不离心。
  直接加培养基＋血清后，放在一个大的 培养瓶里进行原代培养，这样可以减少离心对细胞的损害，以及减少离心过程中的污染机会。
  但是这需要有个前提，就是收集后的细胞悬液（已加培养基和血清）的体积小于培养瓶的容积。
  因为离心的主要作用就是为了收集细胞以得到最大量，好像没有别的作用，但却会增加细胞损伤。
  如果离心单纯为了除去过多的液体，那么何不留着这些液体（主要胰酶，可以用足够量的血清中和）不离心，以减少对细胞的损伤。
  不知道有人这样做过没有，过几天试试。

• NBA (2015-7-09 11:21:01)

  
  再这里问问，你认为血清中和胰酶的比例是多少？
  如0.1％胰酶：胎牛血清？或者小牛血清？

• dior (2015-7-09 11:21:17)

  
  我不知你用的血清浓度是多少,我用的是20%,另外细胞分布不均也会影响其生长,如果有此情况,建议你消化重新让细胞贴壁,分布均匀后生长状态也会好的多.还可考虑增加ECGS的浓度.

• ukonptp (2015-7-09 11:21:46)

  QUOTE:

  原帖由 NBA 于 2015-7-9 11:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我用的那个离心机可以考虑退休了。转速早就不准了，我现在都是离心后肉眼观察，摸索转速。
  另外，关于原代培养时的离心问题。今天又做了一次原代培养，再一次感觉到原代培养步骤复杂，费时。突然考虑到能不能收集到细胞后，不离 ...

  这样很不好，细胞培养液太多，细胞生长的微环境受到的影响就比较大。培养瓶太大，细胞的社会性受到影响，肯定得很长时间才能长满，必然的结果是细胞老化死亡。离心的目的，还可以洗除一些杂质，尽量去除胶原酶。另外，其实，离心一次对细胞的损伤并不大。你可以再买一个离心机啊，才不到一块（普通的小的）。如果你用那么多的培养液岂不是浪费吗？如果不加各种营养成分，那么细胞贴壁也会受到影响的。当细胞离体后，如果不给足够的生长因子刺激，它可能不贴壁，或者在悬浮的同时走向寻短见的道路。因小失大，不太可取。你可以试试，结果必定不好。 Tongue

• ukonptp (2015-7-09 11:22:02)

  QUOTE:

  原帖由 NBA 于 2015-7-9 11:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  再这里问问，你认为血清中和胰酶的比例是多少？
  如0.1％胰酶：胎牛血清？或者小牛血清？

  据说，只要带点血清就可以中和掉胰酶，我做过蚓激酶的实验，1%的血清浓度就足够中和很大浓度蚓激酶。虽说两种酶不太一样，但是从我消化的经验可以知道，5%的血清1ml(是血清就可以，不论胎牛还是小牛)就足足够中和0.25%的胰酶1ml了，甚至更少，更低浓度。所以，消化的时候，务必将含血清的培养液尽量洗除干净。

• NBA (2015-7-09 11:22:36)

  QUOTE:

  原帖由 ukonptp 于 2015-7-9 11:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  这样很不好，细胞培养液太多，细胞生长的微环境受到的影响就比较大。培养瓶太大，细胞的社会性受到影响，肯定得很长时间才能长满，必然的结果是细胞老化死亡。离心的目的，还可以洗除一些杂质，尽量去除胶原酶。另外，其实，离心一次 ...

  根据经验有同感。Thumbs up
  师兄的经验：他一般在离心之前加入血清来终止消化（此时需血清量大）。大家说有这个必要吗？如果没有必要，岂不是浪费血清？