质谱沙龙第三十二期活动报道
运用代谢组学寻找疾病生物标志物方法概述
第二炮兵总医院药学部安卓玲博士作了题为《运用代谢组学寻找疾病生物标志物方法概述》的报告，主要介绍了代谢组学及其应用领域、研究方法和创新点，组合式离子化方式的LC-MS分析方法研究等内容。
第二炮兵总医院药学部 安卓玲 博士
代谢组学是关于生物体内源性代谢物的整体及其变化规律的科学，根据研究对象和目的不同，生物体系的代谢物分析被分为代谢物靶标分析、代谢轮廓分析、代谢物指纹分析和代谢组学四个层次。代谢组学以疾病、机体平衡和体内小分子代谢物紊乱为研究对象，广泛应用于药物研发、病理生理学、中药、营养学、生命科学和重大疾病研究等领域。
代谢组学研究步骤
代谢组学研究一般包括样品采集、样品前处理、样品分析、数据输出、数据处理、结构鉴定和生物学解释等7个步骤。
比较各种样品前处理方法：
- 液液萃取法适用于组织样本，可提取目标成分，但是步骤繁琐。
- 固相萃取法适用于代谢物靶标分析和代谢轮廓分析，能够增强痕量分析物的检测能力，提高回收率，并降低样品对仪器造成的污染，可脱盐、除去蛋白质等干扰，但是步骤繁琐，数据量大，数据交叉。
- 有机溶剂沉淀法适用于血液样本代谢组学研究，能够除去蛋白质等干扰，但目标成分被蛋白质包裹，造成损失；经验表明，甲醇沉淀蛋白最好。
- 直接进样法适用于尿液样品，不丢失代谢物，最大程度保留样品信息，但是样品中的高浓度盐类成分会造成严重的离子化抑制并产生大量的加合离子，还会造成仪器污染，灵敏度下降。
比较各种样品分析技术：有核磁、气相与质谱联用、液相与质谱联用和毛细管电泳质谱等。其中，LC-MS适合较高极性和较大分子量的化合物，样品无需衍生化处理；UPLC/RRLC提高分离能力，缩短样品的分离时间，降低分析物的检测限和质谱检测的离子抑制现象，能够实现复杂生物样品的快速高通量分析；亲水相互作用色谱(HILIC)适合于强极性和亲水性样品分析，提供互补信息。但是质谱技术最大的缺陷是离子化歧视及检测的偏向性。
在数据处理之前，要先进行数据的预处理，这些预处理软件的功能包括：发现峰、识别峰、峰对齐、生成二维矩阵。代谢组学的数据处理软件，按照软件授权形式分为商业软件和开源软件。数据处理中的模式识别，是化学计量学的重要组成部分，是挖掘数据信息的主要方法。无监督学习方法是不需要有关样品分类的任何信息，可以从原始谱图或处理后的信息中对样本进行归类，包括主成分分析(PCA)、非线性映射、族类分析等。有监督学习方法是利用多参数模型，对样品进行识别和分类，由已知分类信息来推测产生样品间发生分类的因素，包括传统的显著性分析(DA)、偏最小二乘法(PLS)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)、软独立建模分类法(SIMCA)和人工神经网络(ANN)等。
组合式离子化方式的LC-MS分析方法研究（ESI、APCI、APPI）
组合式离子化方式的LC-MS分析方法包括离子化能力、适用性和方法学验证三方面。离子化能力是指对尿液中4个核苷、10个氨基酸、2个雌激素和4个有机酸等代表性代谢物标准品的离子化效率。ESI在体液浓度下难以检测半胱氨酸、香草酸、雌三醇和雌酮，APPI在体液浓度下难以检测次黄嘌呤核苷、胞苷、异亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、马尿酸、香草酸和没食子酸，APCI在体液浓度下难以检测胞苷、组氨酸和马尿酸。通过ESI、APCI、APPI离子化方式的RRLC-MS分析方法，检测22例健康人尿液获得的代谢物数目，发现共有代谢物和特有代谢物。通过比较不同浓度的20个代表性代谢物标准品提取离子峰的信噪比，“组合式”离子化方法的检测灵敏度较好，适合于尿液样品的检测。对仪器和方法的精密度验证，各代谢物的提取离子的峰面积的RSD值<20%，符合体液样品检测要求。
安博士采用组合式离子化方式的LC-MS分析方法，通过质控样品与混标样品来监测分析系统的稳定性与仪器的精密度，对19例肺癌患者与22例健康人尿液样品进行检测。检测过程中，分析系统的稳定性较好，仪器的精密性良好，RRLC-MS谱检测结果可靠。对检测得到的代谢组学数据进行OPLS-DA分析，获得了共有及特有的可能生物标志物，并对可能生物标志物的结构予以解析，比较特有可能生物标志物的检测结果。最后，安博士对可能生物标志物生物学意义作了初步阐释：氨基酸的含量增高，癌症患者体内蛋白质代谢紊乱;修饰核苷的含量增高，癌症患者体内RNA周转加快，肿瘤细胞中tRNA修饰酶活性增高，造成高度修饰RNA片段；吲哚酚的含量增高，虽未见吲哚酚与癌症相关的报道，但其与肿瘤发生和癌症扩散有关。
AB SCIEX SelexION™技术——开创质谱选择性的新纪元
AB SCIEX 公司市场部李春波博士作了题为《AB SCIEX SelexION™技术——开创质谱选择性的新纪元》的报告，主要介绍了SelexION™技术及其应用。
AB SCIEX 公司市场部 李春波 博士
生命科学、环境检测、食品安全等学科应用及面临的问题，对质谱在选择性、分辨率、扫描速度、灵敏度等方面不断提出新的要求，特别是在同分异构体样品分析和共流出杂质分离分析方面。
DMS（差分离子淌度）系统技术特点
离子淌度(Ion mobility spectrometry,IMS)，是一种以化合物的气相离子在电场作用下发生迁移时的淌度来表征该化合物的方法。AB SCIEX在今年的ASMS上推出了具备差分离子淌度分离能力的SelexION™ 技术，结合了SelexION™ 技术的5500三重四极杆 和QTRAP® 5500系统，具有一种新维度的选择性和分析性能，可用于分离同分异构体，消除共流出污染物的影响，降低高的背景噪音，提高数据质量，提高信噪比。离子在DMS中的分离，是通过施加分离电压，根据离子在高电场和低电场迁移的差异来分离离子。
市场上有些公司已经采用，比如有一种是把离子淌度装置放在碰撞室中，这时很多质谱扫描的方式就不能用了，并且这类仪器只能用离子淌度，增加的作用只限于分离某些同分异构体。而AB SCIEX的SelexION装置，离子淌度放在了离子源之后，Q0之前，即产生的离子通过淌度分离后，还可以在后面的任意一级质谱进行原来的各种质谱采集和扫描方式，具有更高的适用价值，它最后的淌度表示横轴是CV(V）（可以区分开同分异构体）。另外，由于离子淌度装置安装在离子源后，任何用户可以无需工具、不停真空、2分钟内拆装，所以用户可以方便地选择：用还是不用离子淌度。在离子源后的这种离子淌度，除了分离同分异构体，还可以降低背景噪音，提高复杂基质中分析物的灵敏度。
还有一类市场上已经采用的，也是放在离子源后，但它是一种同心环，这种方法做MRM的速度不高，另外拆装也不是很方便。而SelexION装置是一个几毫米的平板，在两块平板（10×30mm，1mm间隔）上加RF电压在平板间形成电场，它进行MRM的速度更快（比环形提高4倍），可以更好地进行多混合物分析和兼容于UHPLC的速度。此外，SelexION装置非常棒的特点是，它集成了添加化学修饰剂（如异丙醇、甲醇、乙腈等）的功能，可以把离子淌度的分离能力提高10倍，因为化学修饰剂和样品离子结合，具有动态的成簇（高电场时）/去簇（低电场时）模型，进一步加大了分子之间的差异（如尺寸上的差异）。
另外，SelexIon装置还有一个COV补偿电压，用于校正目标离子的运动轨迹，确保通过DMS到达质量分析器，而基质被有效地去除。SelexIon装置的调谐稳定性非常好，在超过24小时的固定分离电压(SV)下，优化的补偿电压(COV)偏移量小于DMS峰宽(半峰高处的峰宽，通常为2.5V)的10%，适用于定量分析和法规实验室应用。通过血浆样品1000次重复进样(66 hours)，结果显示的重现性和耐用性满足法规生物分析准则。
AB SCIEX SelexION™ 技术
SelexIon装置图
DMS如何分离选择离子
加入化学修饰剂对增大分子差异的作用
分离同分异构体
DMS系统应用
DMS系统降低了化学背景噪音，广泛应用于同分异构体的分离，共流出杂质的分析，及对复杂基质中的目标化合物的定量分析。下面，李博士列举了一些应用实例：麻黄碱/伪麻黄碱，这对手性化合物的分离；Pentoxifylline（血管扩张药物）的LOQ提高20倍，消除高化学噪音；含有前列腺素F2α(PGF2α)的类花生酸标准品混合物分析，选择性显著提高；尿液中盐酸克伦特罗分析，显著降低和消除了共流出杂质干扰；对B性脑钠肽的32个氨基酸分析，显著降低和消除了共流出杂质干扰；相同分子量化合物的分离等。
最后，李博士总结说，AB SCIEX Triple Quad™ 5500和QTRAP® 5500系统的SelexION™技术，开创了选择性和分析效率的新纪元。降低背景噪音，提高了数据质量和检测限；对同分异构体，特别是手性化合物具有很好的分离能力；应用化学修饰剂显著提高了DMS系统的分离能力；卓越的系统稳定性和重现性满足生物分析确证的需求；提高通量降低对色谱分离和样品制备的要求。
相关仪器：
SelexION™ 差分离子淌度装置
二炮总医院 李鹏飞 老师
本次沙龙，二炮总医院李鹏飞老师主持了专题讨论，大家围绕“生物样本前处理——柱洗脱——色谱柱——分析时间”选择与取舍，LC-MS/MS应用中问题原因分析和定量指导原则探讨等问题进行了热烈的讨论，大家都获益匪浅。
