质谱沙龙第三十二期活动报道

2011-8-01 19:13 来源: 分析测试百科
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  2011年7月31日,第三十二期质谱沙龙活动在航天中心医院成功举行。来自第二炮兵总医院、航天中心医院、AB SCIEX公司、北京艾米诺医学研究有限公司、华质泰科生物技术(北京)有限公司等近三十位专家、学者、技术工程师等参加了本次沙龙活动,共同探讨质谱技术及其在生物医药方面的前沿应用。

质谱沙龙活动现场

药代研究中LC-MS/MS定量方法国内外指导原则的初步解读

  航天中心医院临床药理室张丹老师作了题为《药代研究中LC-MS/MS定量方法国内外指导原则的初步解读》的报告,介绍了SFDA2005、FDA2001和EMA2010指导原则的适用范围、涉及方法、方法确证和方法应用等内容。

航天中心医院临床药理室 张丹 老师

  从三者在适用范围和涉及方法上的差别来看,SFDA2005主要涉及到临床实验,FDA2001和EMA2010涉及到临床实验和临床前,还包括动物的一些样本分析。方法主要有气相色谱、液相色谱、气质联用、液质联用,也有串联质谱等。EMA2010只讲到免疫学方法,而SFDA2005和SFDA2001都讲到微生物法和免疫学法。下面,张老师将重点解读指导原则的方法确证和方法应用。

  方法确证

  方法确证包括完整方法确证、部分方法确证和交叉方法确证。

  1、完整方法确证

  一般对于新的方法、新的化合物和已有方法追加待测物进行同时测定时,都需要进行完整方法确证,其主要涉及到选择性、基质效应、残留效应、标准曲线、灵敏度、准确度和精密度、回收率、稳定性和稀释等九点。

  选择性:SFDA中称为“特异性”,要求分析方法能够准确、专一地测定分析物,至少要考察6个不同个体的空白生物样品,目的是证明目标分析物,内源性物质、相应代谢物、降解产物不干扰目标分析物的测定,同时测定的多个分析物不互相干扰;FDA和EMA要求能够区别和定量生物样本的内源性物质,以及含有其它的一些成分,要考察6个不同来源的空白生物样品,并要考察LLOQ,并讲了更多的一些干扰物质,如合并用药、代谢物向母体药物转化等。接着,张老师讲了3个例子:同时测定两个代谢物时,这两个代谢物具有相同的离子对;化合物X葡萄糖醛酸化代谢物的裂解;复方制剂的分组测定,及针对其选择性所做的工作。

  基质效应:SFDA要求对于以软电离质谱为基础的检测法(LC-MS、LC-MS-MS)应注意考察分析过程中的介质效应,如离子抑制等;FDA的要求涉及到第8、11和12页,但没有说明如何考察;EMA要求在质谱法时要考察这些效应,至少要用6个不同来源,最好能包括溶血的、高血脂的和特殊人群的样本,考察低浓度水平的,不高于3倍的LLOQ,做法是提取空白基质,分别加入内标,然后根据得出的结果进行计算。

  残留效应:残留效应只有在EMA2010中提到,在一个高浓度样本后面,紧接走一个BK空白生物样本,目的是测定高浓度样本是否有残留对低浓度样本造成干扰,接受标准与选择性类似。影响残留效用的因素主要有仪器性能、线性范围和化合物性质等。

  标准曲线:三个指导原则提到的基质都要求与待测样品相同生物介质。浓度点设置,SFDA要求6个和空白,FDA要求6~8个和空白,还要有一个零点样本,EMA要求不少于6个和空白,也要一个零点样本。定量原则,三个指导原则都要求不得外推。RE也一致,在最低定量限允许有±20%的误差,其它的浓度点允许±15%的误差。接受标准,SFDA要求各浓度点相对误差在接受范围内时,标准曲线合格,FDA要求≥2/3的浓度点应在接受范围内,EMA要求≥3/4的浓度点应在接受范围内。提供数据,三原则的各点浓度偏差、回归方程和相关系数是一致的,只是FDA和EMA要求不合格的浓度点不纳入回归计算。

  灵敏度/定量下限:三原则定义都是标准曲线最低浓度点,SFDA和FDA要求每批至少做5个浓度,EMA要求至少要在2天之内连续3个分析批,而且每批都要做5个。SFDA和EMA对信噪比没有要求,而FDA有5倍响应的要求。接受标准,SFDA要求RSD<20%,FDA要求RSD≤20%,EMA要求平均是20%,内部和之间RSD≤20%,内标IS 的RSD<5%

  准确度和精密度:要求用3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。EMA中将LLOQ纳入到准确度和精密度,也提到要做3个分析批。SFDA中低浓度选在LLOQ附近,浓度是LLOQ 3倍以内,中浓度是中间选个浓度,高浓度接近ULOQ,FDA与SFDA类似。为获得批间精密度,三个原则都是在不少于2天内,应至少连续3个分析批合格,而且每批都要做5个。接受标准,SFDA准确度是85~115%(定量下限附近为80%~120%),精密度<15%,EMA要求RE在±15%内,RSD≤15%。

  回收率:SFDA考察高、中、低3个浓度的提取回收率,其结果应精密并具有可重现性,FDA与之类似,而EMA没有提到。

  稳定性:SFDA是根据具体情况,对含药生物样品在室温、冰冻和冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察;还应注意考察储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性。FDA是要考察冻融稳定性、短期室温放置稳定性、长期放置稳定性、储备液的稳定性、以及提取之后的稳定性,应该至少考察两个浓度水平,样本量不少于3。EMA与FDA相类似,但是多了实验台的考察。

  稀释:FDA提到要是浓度超过ULOQ,就要做稀释方法确证,要阐述稀释因子准确度和精密度。EMA对此进行了详细阐述,要是浓度超过ULOQ,一定要进行稀释方法确证,稀释因子必须进行阐述,用已知的高于ULOQ浓度的QC,用相应的空白样本进行稀释,每一个稀释因子至少要做5个,误差要在±15%内,RSD≤15%,稀释过程要能包含整个应用。

  2、部分方法确证

  SFDA没有提到部分方法验证。FDA在列出了一些情况下要进行部分情况验证,如实验室改变,检测器改变,抗凝剂改变,基质改变,样本制备方法改变,浓度范围改变,仪器或软件平台改变,样本量有限,稀有基质和额外的选择性考察等。EMA仅在实验室改变,仪器改变,浓度范围改变和样本保存条件改变等,要进行部分方法验证。总之,应根据原分析测定方法中改变的条件及程度,合理确定部分方法确证的考察内容。

  3、交叉方法确证

  SFDA中没有提到交叉方法验证的问题,FDA是在实验室之间比较和不同分析方法比较之间进行交叉方法验证。EMA只是在实验室比较用交叉方法验证。

  方法应用

  方法应用就是怎样去测样本,它主要涉及到三个方面:分析批的内容,分析批可接受的标准和未知生物样本的复测。另外,EMA2010新列出一条,即对已经测过的样本要进行复测,该复测与上面不同,其目的是检测实验室方法的整体重现性。

  确定分析批。SFDA提到每个分析批要有一个标准曲线,随行测定高、中、低3个浓度的质控样品,同方法确证;浓度设置也同方法确证,每浓度至少2样本,且质控样品数应>未知样本总数的5%,均匀分布;同一个体的生物样品,最好在同一批中测定。FDA也要有标准曲线,同方法确证,浓度设置也同方法确证,总数≥6,且≥未知样本总数的5%,还有系统适应性等问题。EMA标准曲线同方法确确证,浓度设置也同方法确证,至少3个浓度水平,每浓度至少两样本,且总数≥未知样本总数的5%,同一个体的生物样品最好在同一批中测定。

  接受标准。SFDA标准曲线的接受标准与其方法确证一样,EMA也一样,而FDA要求LLOQ的误差在20%以内,其它误差在15%以内,不少于75%的浓度点应在接受范围内(包括LLOQ、ULOQ)。QC方面,SFDA要求偏差<15%,最多允许1/3的质控样品结果超限,并且不能出现在同一浓度质控样品中;FDA、EMA与SFDA相类似。

  复测。SFDA是每个未知样品一般测定一次,必要时可进行复测。FDA在法规要求,双样本测标不一致,样本超过定量范围,样本萃取过程出现问题,仪器故障,色谱行为不好和不合理数据等情况下要进行复测。EMA在QC不合格,内标的响应有显著的差异,进样出问题,高于ULQ,低于LLOQ和有污染等情况下要进行复测。对于FDA和EMA,同时测定多个待测物时,针对结果异常的待测物复测,结果正常的待测物应采用原测定值;样本复测的理由,最终采纳的测定值、采纳该值的理由,均应详细记录。

  最后,张老师讲了EMA特殊的要求Incurred sample reanalysis,即已经测过的东西,要再重新测定一遍,这不是复测(reassayed samples),主要目的是为了考察这个方法和实验室的重现性。介绍了重新测定的原因、测定时间、测定方法和接受标准等。

      在逐条对比中,张老师提出了很多非常细致的问题,大家进行了详细的讨论。