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近期《自然》期刊系列中发挥关键作用的赛默飞质谱仪

2012.1.16

   【导语】在2011年10-11月期间,在一级科学刊物Nature和Nature Methods上有14篇科研论文使用赛默飞世尔LTQ-Orbitrap或TSQ质谱仪产生数据,聚焦的主题包括:目标物发现与定量研究,Top-down蛋白质组研究绘制蛋白质异构体,同位素标签方法的精度,提高糖蛋白质组的鉴定产率,基因沉默引起的核酸内切酶活性研究,真菌效应器引起的代谢变化,细胞凋亡研究等。下面请小编带您概览一下这些文献及其创新之处,作为对2012新年的献礼,希望对您的研究工作有所启发,也希望您的工作可以更快地更多地发表在这些top journal上……

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     在2011年10-11月其间,在一级科学刊物Nature和Nature Methods上有14篇科研论文使用赛默飞世尔LTQ-Orbitrap或TSQ质谱仪产生数据。这14篇科研论文的主题包括:目标物发现与定量研究,Top-down蛋白质组研究绘制蛋白质异构体,同位素标签方法的精度,提高糖蛋白质组的鉴定产率(Steentoft等),基因沉默引起的核酸内切酶活性研究,真菌效应器引起的代谢变化,细胞凋亡研究等。

      整个科学界都知道,在《自然》期刊上发表文章是非常著名的,这些文章往往是被高引用的文章,这可能会导致促销、基金资助等,并得到主流媒体的关注。在现代历史上多次最重大的科学突破都被首次刊登在《自然》上。大多数期刊往往是专门化的,而《自然》往往跨越不同领域,因此其审核的标准是非常严格的。《自然》的确是排名第一的期刊,从事研究的科学家们是该期刊的主要读者,而它的摘要和伴随摘要的文章往往是最重要的文献,并可被其它领域的科学家们和受过教育的广大公众很好地理解。

  下面我们就来一睹为快:

  1、Rapid empirical discovery of optimal peptides for targeted proteomics

     基于实验快速发现适合用于目标蛋白质组学定量的最佳肽段  

          A.B. Stergachis et al.  Nature Methods. 2011 Nov 6;8(12):1041-3. doi: 10.1038/nmeth.

  问题:如何选择最优化的酶解肽段,既可以容易地被质谱检测,又具有目标蛋白质定量需要的特征碎裂方式

  仪器:TSQ Vantage三重四极杆质谱仪,LTQ Velos双压线性离子阱质谱仪

  解决方法:作者报道了一种可规模化、经济的方法,基于实验基础来产生合适的且具有好的碎裂方式的酶解肽段。比起依靠不完善的谱图数据库、理论预测算法、合成肽段,或购买全序列蛋白质,作者收集标签cDNA克隆体来体外合成全序列蛋白质,再用trypsin酶解和MS进行SRM分析。

  选择的或可供选择的赛默飞产品:体外合成全序列蛋白质采用Thermo Scientific旗下品牌Pierce的人类体外蛋白质表达kit。用于绝对定量的重标肽段购于Thermo。SRM方法建立由Skyline软件完成但也可以用Thermo的Pinpoint软件完成。用Q Exactive也可以,和该文中TSQ Vantage一样,进行方法建立和重组蛋白分析。

 

  2、MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics

        MS3减少同位素标记定量蛋白质组学实验中的比率失真

  L. Ting et al.  Nature Methods. 2011 Oct 2;8(11):937-40. doi: 10.1038/nmeth.1714.1770.  

  问题:同位素标记实验中,选择用来碎裂的母离子会影响数据的准确度和精确度,目标离子附近的同位素离子峰会被同时选择和碎裂,影响报告离子强度的准确性。

  仪器:LTQ Orbitrap Velos

  解决方法:作者选择MS3代替MS2来进行定量和鉴定,从而消除MS2中被选择的母离子被具有相似m/z值得离子干扰。

  选择的或可供选择的赛默飞产品:要能使用MS3消除报告子比率失真,需要LTQ-Orbitrap的MSn功能。最新的Orbitrap Elite具有更快的扫描速度,可以提供更多的肽段/蛋白质鉴定和定量。

 

  3、Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging

        气相纯化带来准确、多通道的同位素标签蛋白质定量

  C. Wenger et al. Nature Methods. 2011 Oct 2;8(11):933-5. doi: 10.1038/nmeth.1716.  

  问题:同位素标记定量中定量数据的准确性和精确性

  仪器:LTQ Orbitrap Velos ETD

  方法:介绍了一种新方法叫做“QuantMode”:选取母离子,用ETD的阴离子碰撞使其价态减小,假设之前被一起选中的(“co-selected”)具有相同m/z的干扰离子具有不同的价态,在价态减小之后,目标离子和干扰离子的m/z不再相同,可以被更精确地选取出来。

  选取出的价态减小的离子用HCD裂解,同样的母离子再次用离子阱的CID裂解,结果产生了经过对同一目离子优化碰撞能后的两个系列的碎片离子。HCD裂解含有不受影响的报告子,CID给出离子序列信息,这两组离子用C trap收集后一起送入Orbitrap分析,优点在可以提高测量的准确性。

  选择的或可供选择的赛默飞产品:需要用ETD技术来获取价态减小的离子。

 

  4、Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics

       Top-Down蛋白质组学绘制完整蛋白质异构体

  J. Tran et al.  Nature. 2011 Oct 30;480(7376):254-8. doi: 10.1038/nature10575.  

  问题:提高自上而下(top-down)蛋白质组学有限的覆盖率

  仪器:Orbitrap Elite和LTQ FT

  方法:用四维分析(二维电泳,LC和MS)鉴定人类细胞中1043个基因产物,这些产物又因为翻译后修饰(PTMs),RNA 剪切(splicing)和水解而衍生为3000多种蛋白质。整个系统的分离能力和蛋白质覆盖率提高了20多倍。该研究代表了迄今为止top-down质谱法在提高蛋白质组覆盖率方面的最高水平。

  选择的或可供选择的赛默飞产品:Orbitrap Elite提高的分辨率和更快的扫描速度可配合LC做Top down分析。各种裂解方式结合(HCD,CID和ETD)提高序列覆盖率,从而鉴定和区分蛋白质异构体。

 

  5、Mining the O-glycoproteome using zinc-finger nuclease–glycoengineered SimpleCell lines

        利用锌指核酸酶-糖化设计的简单细胞系来挖掘O-糖蛋白质组

          C. Steentoft et al.  Nature. 2011 Oct 30;480(7376):254-8. doi: 10.1038/nature10575.  

  问题:基于RNAi的基因沉默技术还未被证明对细胞的糖基化工程(glycoengineering) 有效,可能是因为在内质网(ER)-高尔基体膜积累中糖基转移酶发挥作用,减慢了转化。

  仪器:LTQ Orbitrap XL ETD

  方法:基于锌指核酸酶(ZFN)的基因打靶技术是一种独特的工具,可高特异性地使基因变异。作者使用COSMC(b1,3-GT的重要的特异性蛋白伴侣)的ZFN基因打靶,对稳定的、带有简单O-糖基化的人类细胞株进行糖基工程化改造,显示只有截断的Tn和STn O -聚糖,被称为“SimpleCell'系(简单细胞系)。

  简单细胞系使作者使用修饰后的LWAC 凝集素色谱柱和nLC-MS/MS(纳升液相色谱-串联质谱)技术,来研究人类细胞的O-糖基化蛋白质组,发现了许多O-糖蛋白和糖基化位点,包括以前未被鉴定过的酪氨酸残基连接位点。作者鉴定了100多个O-糖蛋白和350多个糖基化位点(很多是以前从未报道过的),包括一个酪氨酸残基的GalNAc O-聚糖连接位点。文章中强调了用ETD技术鉴定糖肽,以及用HR/AM技术监测糖链水合氢离子这两种功能的重要性。

  选择的或可供选择的赛默飞产品:多种裂解技术(HCD和ETD)对于表征完整糖肽的重要性。用HCD来鉴定糖链结构/组成,ETD鉴定肽段序列和糖基化位点。只有赛默飞仪器才能实现的HCD-PD-ETD策略可以提高duty cycle和动态范围,比交替的数据采集方法,HCD-PD-ETD可鉴定出更多的O-糖肽。

  相关名词释义:

  基因打靶技术(Gene targeting technology):是指通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点,以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术。

  COSMC:核心I b3-半乳糖基转移酶特异性分子伴侣,COSMC是 b1,3-GT的重要的特异性蛋白伴侣。

  cell line 细胞系:可以在试验室培养的、可以储存的纯化的具有某些特定基因特征的细胞。

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