ETD：将成为蛋白质组学研究的标准方法
——访赛默飞ETD技术发明人John E.P. Syka 博士
【导语】质谱已经成为开展蛋白质组学研究的基础平台，更确切地说，具有MS/MS功能的质谱已成为蛋白质组学研究的基础平台。过去，CID/CAD技术是实现MS/MS功能的唯一手段，在蛋白质鉴定的自下而上（Bottom-up）时代起到了关键的作用。随着研究的深入开展，科学家们面临着蛋白质的翻译后修饰鉴定、自顶而下（Top-down）的完整蛋白质裂解研究等一系列新的挑战，ECD和ETD技术的出现，在应对这些研究挑战中展示出诱人的前景，因此从2003年开始，研究者们每年召开一届乌普萨拉电子捕获（ECD）与电子转移裂解（ETD）国际会议来全球交流并分享成果。在第十届会议于北京召开时，我们有幸采访到赛默飞ETD技术发明人John E.P.Syka博士，他将为我们描述自己的发明历程，并为我们展示ETD技术应用的前景……
John E.P.Syka博士
Syka：发明ETD 绝不是偶然
Syka首先就表明他不是公司的市场人员，我们在访谈中的确感受到了研发人员的谈话风格，在每一个问题上Syka都谈得过于具体，包括他如何毕业、如何骑着自行车到赛默飞面试、自己的家庭、自己的每一次项目是如何开始的、中间遇到了什么样的问题、具体是怎么解决的，等等等等。每当我们问到中间的某一个产品、某一项技术的问题，Syka就会展开详细地描述。乍一听，觉得很boring，但仔细一想，真正牛×的公司研发人员可能真的是这样的。正是在这些非常细节的、一丝不苟的作风中，诞生出了真正伟大的、影响全世界人民的创新产品。
我们把Syka的经历简单概括一下，可以理清一个脉络。
Syka于1977年毕业于斯坦福大学，应聘到位于San Jose的Finnigan（现在是赛默飞的色谱质谱部）公司做电子学工程师。随后，他在George C. Stafford的项目组，和团队一起设计出第一台商品化的离子阱质谱ITD（1983年）。此后又参与了赛默飞几乎所有的质谱相关研发和商品化项目，比如四极杆、三重四极杆、AGC（用于离子阱的自动增益控制）、离子阱、Orbitrap质谱等等。在设计开发ITD离子阱质谱后，Syka到Don Hunt实验室、Graham Cooks等大学的实验室，和学术界著名的质谱科学家一起合作，开发新的技术，并把技术变成了最终的产品。可以说，Syka和赛默飞推出的几乎每一款质谱，从前期的设想到后来的产品，都有着密不可分的关系。
比如在1983年推出商用离子阱质谱后，Syka就提出设计一种“ICR-like”的更好的离子阱的设想，并因此去Don Hunt的实验室深入研究FTICR-MS、线性离子阱的技术，Don Hunt后来发明了从ICR池中弹射（ejection）离子的技术，最终变成了2003年赛默飞推出的商品化LTQ，虽然，LTQ的第一发明人是Jae C. Schwartz。我们也很容易地发现，LTQ的线性离子阱分析器，和FTICR-MS的离子回旋共振池（ICR）模样的确很相似。这以后，Syka和同事们仍旧持续研究，进一步改进离子阱，努力让其可以达到像FTICR-MS那样的镜像电流检测，并获得接近FTICR-MS的性能。他们曾尝试过各种方式，如设计：FT-Ion Trap，Linear FT Ion Trap，Hybrid Magnetic FT Ion trap等。
当Syka和其同事见到了位于曼彻斯特的Alexander Makarov后，他们一起做了一个重大的决定，提议赛默飞购买Alexander 所属的HD technolies公司，支持其攻克最后的难关，并于2005年推出了划时代的Orbitrap。
Syka由于其最早的设计“ICR-like”离子阱的设想，在LTQ和Orbitrap项目上，都当了好的“伯乐”；而在ETD方面，他成为真正的被世人记住的发明人。Syka同我们分享了从2002年底开始、到2004年发明ETDZL，2005年推出用于LTQ上的ETD的历程，他们用一台赛默飞1981年产的MAT 4500 GC-MS的负化学源来做实验，其间克服了真空、灵敏度等一系列问题，最终的结果，使他的发明获得了PITTCON® 2007编辑推荐银奖。2008年，ETD技术用在了LTQ Orbitrap上，让科学家们更为振奋。著名蛋白质组学研究专家Steven P. Gygi博士表示：“在LTQ Orbitrap中引入ETD技术在蛋白质组学中将是个里程碑事件，ETD将是下一代蛋白质组学的主流和前沿技术，它的应用将如此广泛，以致于我难以想象今后研究或核心质谱实验室中有不用到该新技术的系统。”
所以，Syka发明ETD，绝不是偶然！
赛默飞色谱质谱部市场经理王勇为博士（左）与John E.P.Syka博士（右)
为什么要使用ETD技术？
在当前的蛋白质鉴定中，CID（CAD）碰撞诱导解离是最常用的肽段碎裂技术，CID 常应用于采用胰蛋白酶（trypsin）酶切、在质谱仪中离子化的肽段。肽碎裂过程主要产生 b 和 y 类型的离子。CID（CAD）技术的优点是：可产生丰富的子离子，已被广泛使用了几十年。其缺点是：（1）虽然可观测到由于翻译后修饰（PTM）产生的中性丢失现象，但不容易保留PTM翻译后修饰的基团特点。（2）序列离子的相对丰度存在较大的变化。（2）对于非胰蛋白酶酶切的较长肽段，高碱性肽、天然蛋白，产生的序列离子较少，使得鉴定结果的可靠性显著降低。
肽链碎裂点示意图
1998 年，McLafferty 等发现了蛋白质电子捕获碎裂（electron capture dissociation, ECD）的现象，进而应用到蛋白质鉴定领域。与 CID 基于碰撞能量再分配的基本机理不同，ECD 一般是通过低能量的自由电子与质子化的多电荷蛋白质或肽离子，在相互作用的过程中由于放热而瞬间产生碎裂，它是一个非各态历经（nonergodic）的过程，主要产生由 N—Cα键的断裂而形成的 c 和 z 类型离子。
ECD的优点为：（1）碎裂机理不同于CID，不受限于肽的长度、序列，（2）保留了PTM，（3）对于非胰蛋白酶酶切的较长肽段，高碱性肽、蛋白离子，可产生丰富的序列离子。但使用ECD有很大的限制：由于要同时容纳多电荷蛋白质或肽离子与自由电子在离子阱质谱仪中技术上所面临的困难，ECD只能用于昂贵且运行维护成本极高的FTICR-MS上，ECD 在蛋白质组学中的应用受到了仪器方面的限制，并没有获得广泛的开展。
ECD机理，文献：J. Am Chem. Soc. 1998, 120, 3265-3266, Roman A. Zubarev； Neil L. Kelleher, 和Fred W. McLafferty
ETD机理，US2005199804 (A1) ：Electron transfer dissociation for biopolymer sequence analysis
Hunt和Syka等于 2004 年发现，通过携带一个电子的阴离子（anion）与肽阳离子（cation）相互作用，也可以产生类似 ECD 的碎裂行为，他们称之为“电子转移解离”（electron transfer dissociation, ETD），进而，他们通过改进已有的LTQ线性离子阱质谱仪，在LTQ的后端添加通过化学离子化（CI）的方法引入携带电子的阴离子，然后与肽阳离子在离子阱中相互作用而产生碎裂，发明了一套完整的 ETD 技术。ETD技术具有上述ECD技术的所有优点，ETD获得MS/MS的时间只需100 ~ 300 毫秒，比ECD更容易满足蛋白质组学高通量测定的要求，同时线性离子阱质谱仪维护简便、购买花费低、已被广泛接受，因此ETD技术被迅速推广到众多实验室，Syka表示，全球已有数百台赛默飞的LTQ或LTQ Orbitrap质谱安装了ETD。
安装在LTQ上的ETD，肽/蛋白正离子从LTQ前端透镜进入，被Trap后送入LTQ的前端四极杆区（Front Section），用一台气质联用的负化学源产生负离子，从LTQ的后端送入，稳定后，送入LTQ的后端四极杆区（Back Section），然后将正离子和负离子一同送入LTQ的中心四极杆区（Center Section）进入离子/离子反应，生成的c、z离子送出LTQ在Detector1和Detector2双检测器中检测。
安装在LTQ Orbitrap上的ETD
ETD的典型应用
1、翻译后修饰和二硫键分析
PNAS | February 13, 2007 | vol. 104 |no. 7 | 2193-2198，Analysis of phosphorylation sites on proteins from Saccharomyces cerevisiae by electron transfer dissociation(ETD) mass spectrometry，使用LTQ XL，上图是CAD的MS/MS谱，只能显示磷酸化肽中性丢失后的离子，而对应的ETD谱，可以显示丰富的序列、磷酸化的位点，保留的磷酸化肽等信息。
前文已述，CID/CAD对于常见的翻译后修饰（PTMs）等容易形成中性丢失，ETD在测定磷酸化修饰等翻译后修饰方面具有显著优点，ETD主要断裂主链，可以得到丰富的c、z序列离子，而且保留修饰的基团，如磷酸化修饰、N-和O-糖基化修饰、磺化修饰等。
另外，ETD还被证明可以引起二硫键断裂，获得蛋白质二硫键的丰富信息。
2、高碱性蛋白/肽：如组蛋白Histone
对于高碱性的蛋白/肽，CID/CAD也很难得到丰富的序列离子，而ETD非常擅长，这对组蛋白（Histone）的研究非常有用。而组蛋白对于研究基因调控、新药开发非常重要。应用ETD技术研究组蛋白，已发表在Science这样的重要期刊上。
用ETD研究组蛋白Histones: Science 318, 444(2007) , 研究去甲基化Demethylated 和氧化Oxidized的H4
3、更适用于Top-down流程
用ETD/PTR技术分析了Hela 细胞中得到的组蛋白 H3. 1 和Chicken 红细胞中的H2A. Z 的蛋白N端和C 端的15～40 个氨基酸序列。PNAS, July 5, 2005, Vol. 102, No.27, 9463-9468, Protein identification using sequential ion/ion reactions and tandem mass spectrometry
蛋白质组学近年来兴起的Top-down方法，在用CID/CAD时遇到较大的困难，因为CID/CAD对于带3个以下电荷的肽段断裂较好，不太适用于带高电荷的更大的蛋白。而ETD 能够很好地裂解带有更高电荷的大片段肽段和完整蛋白，得到几乎完全断裂的肽段。随着谱图解析技术的增强，以及在ETD基础上发展的PTR技术质子转移电荷还原反应（proton transfer/ charge reduction , PTR) ，ETD将在完整蛋白的Top-down、de novo测序方面发挥更大的作用。
此外，在蛋白质组学具体体系的研究中，CID/ETD二者的有机结合可以显著提高蛋白质鉴定的序列覆盖度。CID 适合使用胰蛋白酶（trypsin）酶切的肽段，这样的肽段一般仅在两端带有碱性基因(N 端的自由氨基和 C 端赖氨酸或精氨酸的碱性侧链基因)；而ECD/ETD 更适合用 Lys-C 等产生碱性氨基酸较多的酶来酶切蛋白质，生成的肽段碎裂质量较高。
ETD将成为蛋白质组学研究中的标配
正是因为ETD在翻译后修饰、二硫键测定、Top-down技术、组蛋白分析等方面的应用前景，赛默飞已售出了数百套ETD。对ETD技术的应用前景，Syka博士表示：
（1）ETD技术还需要更多地推广，并培训研究者们更好地使用。毕竟，CID技术应用出现了几十年，研究者们无论怎么用，总是可以得到一些结果，不会产生有预想非常大的差距。但对于ETD技术，研究者们首先要有一个了解和认识，才能用好它。
（2）ETD将成为蛋白质组学研究的标配。相比第一台，最新的ETD质谱在设计上已经做了很多改进，性能、软件各方面已经提高很多。但是仍然不能像CID那样，随便调置一下设置就可以得到结果。这也是今后ETD发展的一个方向，需把它做成一种标准流程化的方法，无论怎么使用都可以得到有用的信息。
（3）ETD和CID是一种互补的技术。目前，CID使用得最多，是最常用的一个方式，但像组蛋白、Top-down分析、翻译后修饰定量等，用ETD更合适。
最后，Syka博士说：“假如想看得更远，做得更加深入，就要考虑使用ETD技术。”
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附：赛默飞领先的ETD产品
在ETD技术发明后的第二年(2005年)，赛默飞就首先推出了带有ETD功能的LTQ型质谱仪, 2007年又推出了改良型的LTQ XL质谱仪，2008年继续推出可同时支持高分辨率和低分辨率测量ETD碎片质量的LTQ Orbitrap XL 质谱仪，它已是目前市场上最高端的具有ETD功能的质谱仪。
相关产品：LTQ XL增强型线性离子阱质谱仪
LTQ Orbitrap XL增加了高灵敏度翻译后修饰分析能力。ETD与LTQ Orbitrap XL联用组成了最先进的蛋白质组学平台, 可以提供三个互补性解离技术，用于蛋白/多肽表征，翻译后修饰(PTM)分析 (尤其是磷酸化)，及Top-down或Middle-down的蛋白和多肽序列分析。
