查看完整版本请点击这里：
【求助】能否在一个表达载体里插入两个蛋白实现同时表达
大家好，问题是这样，两个蛋白MW分别是36KD和56KD,突变任何一个都失去特异底物的降解能力。【求助】能否在一个表达载体里插入两个蛋白实现同时表达
经过序列比对估计这两个蛋白是共同起作用，一个氧化一个还原，从而降解底物。
因此我想设计载体对二者分别表达，同时想做一个共同表达，不知道能不能把两个蛋白连起来放到一个载体里实现共同表达？
谢谢
查看完整版本请点击这里：
【求助】能否在一个表达载体里插入两个蛋白实现同时表达
【求助】能否在一个表达载体里插入两个蛋白实现同时表达
最新回复
huifeng0516 (2013-7-27 09:40:16)
好像风险很大，两个蛋白如果连在一起表达，表达出来的就是这2个蛋白的融合结合蛋白了
是否还能保持各自亚基的功能就很难说了。
如果想在一个载体上，单独的，分别表达出2个单体蛋白，貌似不显示，这样需要一个质粒上有2个翻译起始端，我个人是没有看到过这样的文献
BOSS2011 (2013-7-27 09:40:56)
如果是真核表达，把两个表达框构建到一个载体上进行转化或转染就可以实现共表达了,有一些现成的用于共表达的载体。动物细胞中还有IRES载体可用于共表达。
如果是大肠杆菌或其他原核生物共表达，可以构建两个顺反子到一个载体上，但是步骤可能会比较多，载体比较大，可能会影响质粒复制而影响表达效果。而如果两个顺反子有较大同源部分，则还需要考虑因重组导致的不稳定。
Novagen新出的一款载体pETDuet-1，使用两个T7启动子、两个RBS分别表达两个基因，不过只有一个T7终止子，可以满足楼主的需要。并附质粒图谱。
huifeng0516 (2013-7-27 09:43:27)
QUOTE:
学习了新的pETDuet-1这个容易理解，还真有我猜测的 2个翻译起点这样的表达质粒
但是兄台写的真核方案我不是很明白 ，两段序列放在同一个真核表达质粒上，是不是也像原核 一样，需要两个RBS和2个启动子？
我们这边有把2段蛋白，分别构建到同一种载体上，然后共转染293细胞，实现共表达的。
另外我又想到了一个问题，大肠杆菌为什么不能实现2个含有不同表达序列的质粒的共转化和共表达？
huifeng0516 (2013-7-27 09:43:50)
查了一下资料，有人说两个质粒只要是不同的复制子是可以共转化大肠杆菌
bgf5 (2013-7-27 09:44:16)
谢谢关心~
这两个蛋白要么是一个全酶的不同部分，要么在催化过程中共同作用
不过具体的还要再验证
==================================================
好像风险很大，两个蛋白如果连在一起表达，表达出来的就是这2个蛋白的融合结合蛋白了
是否还能保持各自亚基的功能就很难说了。
如果想在一个载体上，单独的，分别表达出2个单体蛋白，貌似不显示，这样需要一个质粒上有2个翻译起始端，我个人是没有看到过这样的文献
BOSS2011 (2013-7-27 09:44:59)
我们这边有把2段蛋白，分别构建到同一个载体上，然后共转染293细胞，实现共表达的。
另外我又想到了一个问题，大肠杆菌为什么不能实现2个含有不同表达序列的质粒的共转化和共表达？
===========================================================================================================
所说的一个表达框，包括启动子、终止子、读码框等:）嘿嘿。。得包含完整的表达元件。不过真核生物不是用的RBS，AUG的有效起始需要的是Kozak序列。
2段蛋白分别构建到同一个载体上，共转染293是可以实现共表达的，因为：在瞬转的情况下，基因不需要复制即可表达；在稳转的情况下，基因可以同时整合到基因组中，同样可以共表达。
而在大肠杆菌中，大肠杆菌分裂很快，质粒如果不能在大肠杆菌中复制，会在培养的过程中迅速丢失。如果需要两个质粒分别携带不同基因转化后共表达，需要两种质粒都稳定复制。因此这两个质粒属于不同的不相容群，携带不同的抗生素，则可以在双抗生素压力下实现共表达。当然也有人将同一不相容群的不同抗性的质粒转化大肠杆菌，同时使用两种抗生素的压力维持两种质粒的存在而实现共表达。
huifeng0516 (2013-7-27 09:46:02)
QUOTE:
长见识了传送门
-------------------
Kozak序列－－一个重要的名词
Kozak序列, 名词, 三元, 转录, GTP
Kozak sequence
KOZAK是一个女科学家，她研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子两端序列为：——G/N-C /N-C/N-ANNATGG——，如GCCACCATGG、GCCATGATGG时，转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。
(在真核起始过程中，由Met-tRNAi，eIF-2和GTP形成了三元复合体（ternary complex）再结合40S小亚基形成前起始复合物(preinitiation complex)。此复合物的形成分为二步：首先GTP和eIF-2结合，以增加此因子与Met-tRNA．结合的效率。然后三元复合体再与40S亚基结合。核糖体结合位点由起始密码子所决定，在某些起始密码子上游邻接序列也可能十分重要，被称为Kozak序列(ACCAUGG)，它相当于原核的S-D序列。前起始复合物结合5′7meG帽结构并沿着mRNA扫描，借助Kozak序列搜寻第一个起始密码子。)
所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律，若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下：
(1) 第4位的偏好碱基为G；
(2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T；
(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基；
(4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。
Kozak规则是基于已知数据的统计结果，不见得必须全部满足，一般来说，满足前两项即可。
KOZAK写的那篇关于KOZAK序列的文献：
文献名字：Compilation and analysis of sequences upstream from the translational start site in eukaryotic mRNAs
作者：Marilyn Kozak
huifeng0516 (2013-7-27 09:46:26)
2段蛋白分别构建到同一个载体上，共转染293是可以实现共表达的，因为：在瞬转的情况下，基因不需要复制即可表达；在稳转的情况下，基因可以同时整合到基因组中，同样可以共表达。
而在大肠杆菌中，大肠杆菌分裂很快，质粒如果不能在大肠杆菌中复制，会在培养的过程中迅速丢失。如果需要两个质粒分别携带不同基因转化后共表达，需要两种质粒都稳定复制。因此这两个质粒属于不同的不相容群，携带不同的抗生素，则可以在双抗生素压力下实现共表达。当然也有人将同一不相容群的不同抗性的质粒转化大肠杆菌，同时使用两种抗生素的压力维持两种质粒的存在而实现共表达。
===================================================
查了一些资料，发现KOZAK序列也是可以叫RBS区（核糖体结合区）
大肠杆菌的RBS区叫SD序列，因由Shine-Delgarno发现
am10 (2013-7-27 09:47:21)
原核的共表达Novagen 有专门的pET共表达载体
楼上兄弟的文章也有涉及到
Merk的技术资料中，最多可在一个菌中用4个复制原点互不相同的质粒载体表达８个不同的蛋白
每个质粒复制原点不同，因而可以在一个菌种共同复制
每个质粒上都有两个独立的表达盒，用于表达两个外源基因
真核细胞内的共表达与此类似
有图为证
11803614.snap.jpg
caihong (2013-7-27 09:48:25)
huifeng0516 (2013-7-27 09:48:50)
楼上兄弟的文章也有涉及到
Merk的技术资料中，最多可在一个菌中用4个复制原点互不相同的质粒载体表达８个不同的蛋白
每个质粒复制原点不同，因而可以在一个菌种共同复制
每个质粒上都有两个独立的表达盒，用于表达两个外源基因
真核细胞内的共表达与此类似
有图为证
===========================================================
这个问题其实有点类似于多个抗原混合免疫了，一举多得
请教一下，举个例子像pGEX PET42这两种不同的质粒能共转一个BL21菌株么？
一个是T7一个是tac启动子
huifeng0516 (2013-7-27 09:49:39)
也没有做过的战友，介绍介绍经验
qumm1985 (2013-7-27 09:51:03)
两个蛋白的生产中很普遍了 最常见就是表达抗体 ，重链轻链要一起表达 ，我这三个蛋白共表达原核，真核都有表达成功的例子
huifeng0516 (2013-7-27 09:51:33)
QUOTE:
真核共表达比较常见，对原核的共表达有点兴趣，像您所说的3个蛋白共表达，3个都是包涵体还是可溶？分别用的什么载体？3个蛋白共表达时和单独表达时，表达量有明显变化吗？qumm1985 (2013-7-27 09:51:54)
vivian4123 (2013-7-27 09:52:30)
请教一下，举个例子像pGEX PET42这两种不同的质粒能共转一个BL21菌株么？
一个是T7一个是tac启动子
===========================================================================================================
我想你有点混淆了
我上面打的也不是太清楚
准确的说应该是复制子，而不是复制原点（ori)
简单的说，质粒复制子是质粒DNA复制的最小元件，复制子决定了质粒的复制方法
和基因表达元件的启动子不是一回事
启动子决定了基因被什么样RNA聚合酶所识别，是转录起始信号
通常情况下，两种（或两种以上）质粒在同一菌株中能够相容的先决条件是复制子不能相同
如果复制方式相同或相似，利用同一复制系统的两个质粒会在复制和随后向子细胞的分配过程中彼此竟争，这样的质粒在细菌培养物中不能和平共处。这种现象称之为不相容性。（忽然想起泡利不相容原理和洪特规则来了，下面就会说到特例）
然而此种因素没有将选择压力考虑在内，pGEX6p1和pET42都是pBR322 origin，理论上不可以在一个细菌内相容的，但二者抗性不同，在 Amp 和Kan 共同维持下，也会稳定存在于一个细菌内的。
vivian4123 (2013-7-27 09:54:19)
=================================================
构造多顺反子也是可行方案，最常见的例子就是乳糖操纵子了。
但要考虑启动子启动能力强弱与作用距离以及基因大小等问题。
qqq111 (2013-7-27 09:54:37)
谢谢！
huifeng0516 (2013-7-27 09:55:05)
我上面打的也不是太清楚
准确的说应该是复制子，而不是复制原点（ori)
简单的说，质粒复制子是质粒DNA复制的最小元件，复制子决定了质粒的复制方法
和基因表达元件的启动子不是一回事
启动子决定了基因被什么样RNA聚合酶所识别，是转录起始信号
通常情况下，两种（或两种以上）质粒在同一菌株中能够相容的先决条件是复制子不能相同
如果复制方式相同或相似，利用同一复制系统的两个质粒会在复制和随后向子细胞的分配过程中彼此竟争，这样的质粒在细菌培养物中不能和平共处。这种现象称之为不相容性。（忽然想起泡利不相容原理和洪特规则来了，下面就会说到特例）
然而此种因素没有将选择压力考虑在内，pGEX6p1和pET42都是pBR322 origin，理论上不可以在一个细菌内相容的，但二者抗性不同，在 Amp 和Kan共同维持下，也会稳定存在于一个细菌内的。
================================
那按您的意思是可以共存，那能都表达么？
有这方面经验的朋友么
huifeng0516 (2013-7-27 09:56:28)
===================================================
这3个用RBS序列连接的不同基因，用的是同一个阅读框钱的启动子？
【求助】能否在一个表达载体里插入两个蛋白实现同时表达