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【讨论帖】冷冻复性
是《冻干法复性蛋白》。冻干法不建议随便做，太耗费能源，如果有生产线资源或者捎带的话，可以尝试一下。对以后大量生产EGF，IGF这种蛋白粗品可能会很有裨益。不过现在正好过冬天，气候干燥的地方可以考虑一下。【讨论帖】冷冻复性
protocol很简单，就是变性完了冻结，然后抽取早期融化的液体，其中就应该有已经复性的蛋白。
但是很多蛋白可能对冷冻敏感，这个还需要看您的运气了。具体变性液，我是用8M尿素PBS缓冲液Ph8左右加点BME，加9%甘油做冻结保护剂。您完全可以用您实验室的变性液配方，不必限制。
我做过4种蛋白，其中3种确切获得活性。BSE没条件测活，但是获得水溶性。
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【讨论帖】冷冻复性
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最新回复
ukonptp (2013-11-05 23:26:02)
QUOTE:
冰块样品早期融化出来的液体里就没有尿素？阿司匹林 (2013-11-05 23:26:27)
QUOTE:
请问您做的这四种蛋白是本身就以包涵体形式表达的，还是本身是可溶性，但是加尿素变性？我希望您提供的方法能对本身就以包涵体形式表达的蛋白质有作用。
如果可能，请贴一张电泳图一饱眼福。（相信有不少人想看图）
bgf5 (2013-11-05 23:26:52)
看了上面老师们的讨论真的很钦佩，学生想请教一个问题，我想做二维电泳的实验，但是因为起初不知道，标本取好以后没有用ＰＢＳ液冲洗，没有去除表面的血液，这样血液中高丰度的蛋白质会在胶上将会掩盖有意的蛋白质点。。。现在标本保存在液氮中，不知道怎样处理才能去除这些血液成分？？因为都已经冻在一起了。。。。十分焦急，谢谢帮助。。。
寻梅 (2013-11-05 23:27:52)
最先做成的是自己合成的包涵体，大约250aa（在原公司）；之后一种是某大学的包涵体，其后是RnaseB变性灭活做的（用冻干法）；之后是自己灭活BSE（用复性仪）。
BSE的电泳在复性仪的帖子里有，上面的ladder应该是二硫键尚未氧化的结果，用双氧水氧化后，确实减弱。
另外二维电泳似乎对标本要求不是要命的高，解冻之后洗掉血液似乎就可以了。反正冻在液氮（-196）里面该变性的也都变了……估计你不可能之前做过二甲亚砜防冻处理。
寻梅 (2013-11-05 23:28:11)
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也会有点的，但是应该不多，所以提到了用预冷的缓冲液稀释一下防止干扰。
uaubc (2013-11-05 23:28:39)
1、相同的包涵体样品做过其他方式的复性试验吗，如透析，稀释，G25换液？
2、蛋白收率如何？除去那一小部分早期融化的液体，余下的主要样品部分怎么办？
个人认为此方法只是利用了变性剂在低温环境下溶解度较低，除去变性剂而已。相同样品如果用这种方法做可以复性的话，那么用稀释法应该也是可以完成复性的。
寻梅 (2013-11-05 23:29:20)
QUOTE:
相关疾病：赌博
我做的复性仪能直接析出变性盐而不明显冻结试剂，现实条件不允许……只能这样把最原始的protocol摆在这里让诸位有条件的朋友来尝试，以期先发篇论文之后再找深入研究的机会。
反胶团法收率100%，现在似乎也没用……
科研很多程度上近似赌博……
寻梅 (2013-11-05 23:30:04)
余下的主要样品部分您可以利用现有的任何方法继续复性，抽出的少许液体基本可以认为对变性液没啥干扰。
寻梅 (2013-11-05 23:30:27)
发张麻省联系信函的截图，以证所言！
39635515.jpg
tangxin_80 (2013-11-05 23:31:02)
2、蛋白收率如何？除去那一小部分早期融化的液体，余下的主要样品部分怎么办？
个人认为此方法只是利用了变性剂在低温环境下溶解度较低，除去变性剂而已。相同样品如果用这种方法做可以复性的话，那么用稀释法应该也是可以完成复性的。
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稀释法的缺点就是样品后来体积大。
楼主的方案除了低温去除变性剂外，还有一个作用恐怕就是利用低温固化蛋白质的互相作用和碰撞接触，降低复性过程中因蛋白互相粘合形成的沉淀
tangxin_80 (2013-11-05 23:31:19)
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楼主有做过试验么？液体中残留的尿素大概在多少摩尔
ukonptp (2013-11-05 23:31:46)
楼主的方案除了低温去除变性剂外，还有一个作用恐怕就是利用低温固化蛋白质的互相作用和碰撞接触，降低复性过程中因蛋白互相粘合形成的沉淀
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恐怕不是固化。“我做的复性仪能直接析出变性盐而不明显冻结试剂”
我猜测是利用低温，但不是很低温条件，可能是在0到-5度左右，Urea、盐酸胍高浓度的变性剂由于温度下降而析出。为了防止溶液冻结，还可能加入了一些盐类，如NaCl，或甘油之类防冻剂。
透析复性的缺点是不均匀，透析袋壁处的变性剂浓度变化太快。
稀释复性也有浓度变化太快问题，另外体积也是太大。
这个冷冻法如果控制好温度的变化，好像可以均匀地控制变性剂的析出，且样品溶液均一性好。
不管这项技术是否真的能够实现，操作方面也不一定比透析、稀释好（温度控制，常规的试验室没有精确低温控制设备），但思路方面是可以试一试的。
dhpbj (2013-11-05 23:32:17)
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我想看的不是这张图。
我想看的是电泳图。虽然我知道复性得到的蛋白质浓度可能很低，但是应该浓缩一下，测一下浓度，做个电泳。
另外，我有个问题，您说"早期融化的液体，其中就应该有已经复性的蛋白"，这个“早期”是多早？多少体积算早期？
寻梅 (2013-11-05 23:32:51)
QUOTE:
很遗憾，您问的一切我都没法给您清晰的答案！不是我不想，是现实没给我这种机会（本人正在失业中，已经3年。做生物研发不是个人能承受的，虽然我曾竭力去尝试……）。坦率的说用冷冻复性的蛋白浓度一点不低，甚至由于变性盐的析出，导致溶液体积骤减，蛋白浓度较初始几乎翻倍。个人感觉做探索有时是跟着感觉走的，想来“早期”就是够您测活一次的量即可。
寻梅 (2013-11-05 23:33:12)
QUOTE:
多谢版主！稍微更正一点，目前采用的方式不是用-5度这种方式。-5会析出一部分盐的但是距离复性的要求应该还是比较远的。
在设备设计上是把冷冻面放在液体底部，盐（尿素，盐酸胍）密度是1.3左右，所以是沉淀在底部的。越浓的溶液比重越大，包涵体密度也是1.3左右。这样的好处是“废物”都在底部……
寻梅 (2013-11-05 23:34:13)
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我冻过8M的尿素溶液，冰块架在滤纸漏斗上室温融化的结果是下图。很抱歉，没称重估算溶液里面剩余的尿素。您自己有条件估算一下吧！
65022120.jpg
finger (2013-11-05 23:34:39)
非常感兴趣同时也比较困惑。
该方法的实质是一个缓慢降低尿素浓度进行复性的过程，对某些蛋白也许管用，但估计其普及性是不好的，复性的方法如同纯化一样，是没有固定方式可循的。
1、温度对蛋白的折叠有一定的帮助的，有许多的复性就是在18度左右进行的，所以低温有时可能却是一种阻碍；
2、复性缓冲液的组成是相当重要的，楼主使用的配方很简单（当然简单有时也是最适合的），但是我想这样子肯定对许多其他蛋白的作用不大，特别是含有半胱氨酸的；
寻梅 (2013-11-05 23:35:10)
QUOTE:
坦率的说表面上看复性方式是没啥规律可循的，可是有一点是不变的规律——就是变性盐的去除和缓的达到一个临界点复性即开始（蛋白复性始终为两种力量左右，其一是变性盐产生的变性力量，另一是存在于一级结构中的复性力量。这两种力量都有益于复性。变性力能破坏错误折叠，给正确复性以机会；复性力能指引正确折叠。）。这个过程越和缓越具有复性的优势……yyaxw84 (2013-11-05 23:35:31)
晕
我们意外发现这个现象也已经有3年了，但是由于觉得没法放大，无法应用于生产，所以没能继续进行相关研究。
不过我们用的是2M的尿素，实验过程和你的方法略有异同
知音啊。。。
我们当时还想开发复性试剂盒呢，有空咱多讨论下
寻梅 (2013-11-05 23:36:01)
QUOTE:
非常荣幸能有同行者！一个人走的真的很累……说实话没能理解您“没法放大，无法用于生产”这句的意思。纠缠于这个设计三年多了，该想的也都想过了。
恕在下愚钝，能否解惑？感觉这方法太适合大规模复性生产了，设备基本就跟冰箱差不多……
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