新方法：ICP-MS用于癌症临床精准医学
分析测试百科网讯 据珀金埃尔默透露，一种单细胞ICP-MS（SC-ICP-MS）用于临床精准医学的方法被开发出来。
卡铂、顺铂和奥沙利铂（Carboplatin, cisplatin and oxaliplatin）是西方世界最广泛使用的铂类癌症化疗药物。顺铂被认为是有效的，因为其能够结合DNA，形成DNA-铂（Pt）加合物，使其弯曲。然后细胞会修复DNA损伤，否则DNA复制被阻断，导致细胞死亡。
许多癌症一开始就对铂类治疗敏感，但是患者常常复发，显示对进一步顺铂治疗的抗药性。顺铂耐药性是由于三个主要的分子机制：增加DNA修复，改变细胞积累和增加细胞溶质失活。增加细胞输出或减少细胞摄取顺铂构成了改变细胞积累的机制。
顺铂的细胞摄取与肿瘤负荷有关，意味着低细胞内顺铂水平与对顺铂的肿瘤反应降低有关。需要检查单细胞水平的顺铂的摄取和分布，以确定治疗是否有效。进入细胞的更多顺铂导致DNA损伤增加，细胞死亡更频繁。了解顺铂的细胞摄取可以开发新的策略和疗法，以增加对顺铂的肿瘤敏感性。
图1 细胞群中顺铂摄取的可能结果
研究顺铂摄取的问题是如图1所示的方法学。传统上用顺铂治疗细胞群，测量细胞群体中铂的总量。消化细胞，通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）或原子吸收光谱法（AAS）等技术获得Pt浓度。然而，集中的重要性尚不清楚，导致了一些问题：
•浓度对细胞意味首什么？
•是否某些细胞有高浓度，而其他细胞有少量或没有顺铂？
•所有细胞是否具有相同的细胞内顺铂浓度？
这种传统方法的缺点是Pt浓度代表细胞总数而不是单个细胞。因此，传统方法不代表顺铂摄取的分布和个体细胞变异。实际上，顺铂的细胞摄取最有可能不同，但到目前为止，还没有有效的方法评价其摄取。
珀金埃尔默介绍了一种新兴技术，其允许在单细胞水平上定量金属：单细胞ICP-MS（SC-ICP-MS）。 SC-ICP-MS基于单粒子ICP-MS（SP-ICP-MS）技术，可用于溶液中纳米颗粒的定量和评估。这两种技术都是基于测量从单个电池（或纳米颗粒）进入等离子体时产生的离散信号的潜力。每个单元中的金属含量被离子化，产生离子羽流，其通过每秒100,000个数据点的快速数据采集来测量，允许将各个单元内的金属含量定量为每单元格级别的直方图（ag）。与传统方法相比，所得信息产生增加的信息，以测量细胞中顺铂摄取。
实验细胞培养和顺铂治疗
卵巢癌细胞系A2780和A2780 / CP70均用于所有实验。将细胞在补充有10％胎牛血清（FBS，Gibco TM），l-谷氨酰胺（Gibco TM），胰岛素（Sigma-Aldrich TM）和pen / strep（Gibco TM））的RPMI 1641培养基（Gibco TM） ％CO2在37°C。将细胞接种并使其附着到用于血清饥饿实验的培养皿中。移除培养基并用无血清培养基置换约18小时，然后用常规培养基更换培养基以开始顺铂治疗。顺铂在无菌盐水中以1mg / mL重新悬浮，并在处理前动态摇动30分钟。图2显示了样品制备的示意图。细胞用30μM顺铂处理一段时间，在处理后1、2、4和8小时收集样品。为了分析，将细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，并使用非酶细胞解离溶液Cellstripper（Corning TM）收集。将细胞以500g力离心10分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1mL PBS中，通过70μm尼龙网过滤，并通过血细胞计数器定量。将细胞在PBS中稀释至终浓度为100,000个细胞/ mL并保持在冰上直到注射。
图2 显示样品制备步骤的示意图
通过进行时间过程实验来探索顺铂摄取，以分析在细胞群体中顺铂分布如何随时间而变化。用30μM顺铂将两种细胞系处理1,2,4和8小时。在样品分析过程中产生了两个实时图：一个显示了强度响应与样本数的关系，而第二个则采用该数据，并将其更改为直方图，显示响应频率与每单位质量数；两个图都显示在图4中。可以在收集数据之后整合质量分布峰值，如图4中的第三个图所示。
图3 Syngistix单节应用软件模块。
图4通过SC-ICP-MS对顺铂暴露的单细胞的实时分析：（A）测量与强度； （B）峰面积与频率直方图； （C）集成/拟合直方图
图5 随着时间的推移，A2780和A2780 / CP70中的细胞顺铂摄取。（注意：不同尺度的样品）
图5显示了两种细胞系的顺铂时程结果。顺铂治疗1小时，两种细胞系的铂吸收极少。随着时间的推移，来自两条细胞的细胞输入越来越多的顺铂并显示出异质分布。在顺铂治疗后8小时，与其余细胞群相比，A2780和A2780 / CP70细胞系具有较少顺铂的细胞亚群。另外，由于A2780具有比A2780 / CP70更多顺铂的细胞群增加，细胞系在八小时之间存在主要差异。这些结果与文献中早先观察到的结果一致--A2780细胞比其顺铂耐药细胞系A2780 / CP702积累更多的铂。
使用Log Normal曲线拟合每个直方图有助于总结时间过程数据。平均强度为每个时间点确定，并作图绘制显示A2780和A2780 / CP70细胞随时间的顺铂吸收差异，如图6所示。这里，观察到顺铂敏感的A2780细胞在比较时具有增加的顺铂摄取随着时间的推移，耐顺铂耐药A2780 / CP70细胞。
细胞血清饥饿，以确定顺铂摄取的异质分布是否是由于细胞周期的差异。当细胞在组织培养物中生长时，培养物通常是以不同速率生长的异步细胞的混合物，导致在细胞周期的不同阶段的宽范围的细胞，如图7所示。细胞周期的四个部分称为G1，S，G2和M.G1期是第一个（通常是最长的）生长期，随后是S期，其中DNA被合成并复制以准备细胞分裂。接下来是G2生长期，其次是细胞分为两个细胞的M（或有丝分裂）相。因此，顺铂水平的差异可能是由于细胞周期阶段的差异。破坏血清细胞允许从培养基中除去生长因子，细胞将在G1期停滞。
重复比较顺铂和血清饥饿细胞之间摄取差异的顺铂摄取时间实验。血清饥饿试验的结果显示了每个时间点的平均强度并作图，结果如图8所示。这些结果表明，血清饥饿对A2780或A2780 / CP70细胞系中顺铂的摄取没有影响；两者显示与对照细胞相似的顺铂摄取率。因此，这些结果意味着细胞中顺铂吸收的异质分布不是由于细胞周期而是由于其他一些未知的机制。
图6 随着时间的推移，每个细胞系的铂平均强度总结。 结果是n = 3独立实验和绘图平均值±标准偏差的总结
图7 细胞周期的相位。G1是第一个生长阶段。S是合成阶段，G2是第二个增长阶段，M是有丝分裂期。
图8 对照组与血清饥饿细胞的顺铂摄取情况。 这些图显示异质细胞顺铂摄取不是由于细胞周期。 结果是n = 3独立实验和绘图平均值±标准偏差的总结
结论
单细胞ICP-MS被认为是在单细胞水平测量铂的鲁棒方法。使用卵巢癌细胞系A2780和A2780 / CP70来证明顺铂摄取随时间增加。顺铂摄取与顺铂耐药的A2780 / CP70细胞系不同，与A2780敏感细胞系相比，进口水平降低。顺铂吸收人群的细胞差异不是由于细胞周期的变化，因为血清饥饿细胞没有改变顺铂的整体摄取。顺铂摄取的细胞间变异性是由于尚待确定的其他因素。
单细胞ICP-MS分析能够在单个细胞内定量顺铂，并且被认为是用于分析细胞群中顺铂摄取的改进方法。本文介绍了在单细胞水平检测内顺铂的可能性。顺铂摄取的分布在细胞中是异质的，并且从细胞到细胞不同，这可能更加密切地反映肿瘤内发生的情况。
使用单细胞ICP-MS的未来研究将有助于开发新策略，以增加细胞中的顺铂摄取和影响细胞顺铂进出口的新途径。
