荧光测定可变因素比较多，只有选好条件才能获得满意的激发和发射光谱。由于样品和仪器各不相同，因此测定条件不能固定不变。应当寻找仪器最佳条件。 
灯电流 光源灯电流不能超过测定范围，但为了提高测定灵敏度，可以调节灯电流到最大允许值。
波长扫描范围： 对已知光谱特性的样品，不需进行广泛扫描。在测试一个未知光谱特性的样品的激发和发射光谱时 扫描样品时范围应该宽一些。如扫描发射光谱时，在短波方向应该多扫一些，以观测瑞利散射和喇曼散射的影响。 狭缝宽度  选好激发和发射单色器狭缝单色器宽度，是获得一个好图谱的关键。对定性分析来说，希望窄一些，因为狭缝窄谱带纯，能得到精细的光谱。对于定量测定狭缝小，光强弱，会影响测定的灵敏度和准确性，因而狭缝宽度不能过窄。 样品池：进行精确分析时应该使用正方形池。微量池的优点是样品用量少和克服内滤光效应。缺点是狭缝宽度较大时池壁的散射和反射会进入发射单色器，使空白荧光增加。
光电倍增管的电压： 为了提高测定灵敏度，有时可以把光电倍增管的电压提高到最大允许值。但此时光电倍增管容易疲劳暗电流和噪音会因此增加。另外光电倍增管的灵敏度和波长响应与温度密切相关，因此温度较高时要注意散热。 
灵敏度：一般说来，灵敏度越高，所得的荧光强度越大，但仪器噪音和溶液的拉曼光也就越大。有时对于一个稀溶液，为了得到大的荧光强度以准确定量采用大缝宽和高灵敏度，但却会导致散射峰干扰，甚至掩盖了弱小荧光峰。 扫描速度 太快，响应不同步，容易漏掉小峰。