蛋白纯化的三种新工具

2014-4-02 13:04 来源: 生物通
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  蛋白亲和标签是蛋白质组研究中的一个关键性工具,迄今为止人们已经开发出了许多久经考验的蛋白标签系统,例如六聚组氨酸、HA、Myc和FLAG等等。尽管这些标签系统各具特色,但它们也分别存在着一些缺陷,还不能完全满足研究者们的需要。

  为此,Biotechniques杂志盘点了近期出现的三种新蛋白标签系统,以便为研究者们提供更大的选择空间。这三种蛋白标签系统分别利用了高亲和力单抗、无机矿物基质、以及能够剪切标签的金属离子。

  单克隆抗体标签

  日本研究者Yukinari Kato在开发胶质母细胞瘤的治疗性抗体时,无意中发现了一个可用作亲和标签的肽段。Podoplanin蛋白是一个在恶性癌细胞中高度表达的跨膜蛋白,Kato生成的大鼠单克隆抗体NZ-1可以靶向该蛋白中一个14个残基的肽段。Kato在ELISA实验中注意到,NZ-1与podoplanin蛋白的亲和力特别高,于是他与大阪大学的Junichi Takagi合作,希望将其开发成为一个蛋白标签系统。

  研究人员将与NZ-1结合的podoplanin肽段称为PA标签,并将其与现有的其他标签系统进行比较(FLAG、HA和Myc)。他们发现,NZ-1和PA标签之间的亲和力更高,解离更慢。Takagi尝试用这一系统来分离,哺乳动物细胞分泌到培养基中的重组蛋白。这些重组蛋白的初始浓度较低,比较难于分离和纯化。

  研究人员发现,细胞培养液上清中的PA标记蛋白,能够有效结合NZ-1-琼脂糖。此外,0.1 mg/ml的PA标签溶液可以将融合蛋白竞争性的洗脱下来。随后,Takagi又通过NZ-1-琼脂糖层析纯化了15种不同分子量的分泌蛋白,这些蛋白的纯度都超过了95%。

  据介绍,这一系统的关键优势在于,可以在无损抗体柱的情况下很方便的进行再生。研究显示,高盐缓冲液可以完全去除结合在抗体上的PA标签,进行60次结合-洗脱-再生的循环,也不会对柱子的结合能力产生任何影响。

  目前,上述系统还不能兼容人类细胞。“我们正在晶体结构的引导下,设计不识别人类podoplanin的改进版NZ-1,只保留它与标签肽段的高亲和力,”Takagi说。他现在正努力将这一标签系统应用到蛋白质组分析中去,希望能够用其替代FLAG标签。

  磷灰石基质

  人们常常用固化的抗体和金属离子来纯化重组蛋白,不过这些方案并不完美,存在着金属离子析出、稳定性低、和成本高等问题。为此。Jacobs大学的Marcelo Fernandez-Lahore用无机矿物氟磷灰石,开发了一个新的亲和标签纯化系统。

  以磷酸钙为基础的磷灰石(例如羟磷灰石和氟磷灰石),几十年来一直被用作生物分子的吸附剂,其优势在于这种物质既没有抗原性也没有细胞毒性。然而,人们一直未能将它们用于层析法蛋白纯化。这是因为此前的磷灰石基质“颗粒形状不规则,而且在某些条件下很容易溶解,”Fernandez-Lahore说。而近期商业化的CFT珠(macroporous ceramic fluorapatite)解决了上述问题。

  Fernandez-Lahore实验室在这种材料的基础上,开始寻找与氟磷灰石高度亲和的标签肽段。研究人员通过噬菌体展示筛选,发现肽段KPRSVSG与CFT的结合能力很强,于是他们决定将这个CFT结合肽段(CBP)开发成为蛋白纯化的亲和标签。

  研究团队在CFT柱层析实验中发现,由赖氨酸组成的肽段滞留时间更长。于是他们又添加了六个赖氨酸,对原本的CBP进行优化。研究显示,用这种标签纯化融合蛋白,纯度超过了90%。

  研究人员指出,与使用固化抗体或金属离子的传统系统相比,CBP/CFT珠组成的系统可以弥补一些缺陷,是蛋白亲和纯化的另一条宝贵途径。未来,研究人员将会用这一系统,对不同大小、不同特性、不同表达系统(例如哺乳动物或酵母表达系统)的蛋白进行测试。Fernandez-Lahore还指出,这一标签可以“实现可逆的固化,有望应用于医学诊断或细胞分析。”

  二合一系统?

  尽管许多蛋白与亲和标签融合后也能够正常工作,但不少实验还是要求去除这些标签。人们往往将剪切位点设计在蛋白标签旁边,以便用蛋白酶消化时能够将其切下来。

  为了进一步简化这一过程,哥本哈根大学的Niels Erik Møllegaard提出了一个有趣的新标签系统。在该系统中,一个分子可以同时实现亲和结合和蛋白标签的剪切,这个分子就是二价铀酰离子(UO22+)。

  Møllegaard及其团队研究DNA和RNA的铀酰(uranyl)剪切已经几十年了。“这种物质的剪切能力在于它能与磷酸基团高度亲和,” Mollegaard说。“我们尝试用它进行蛋白剪切也有好几年了。”

  四年前研究团队发现,铀酰可以在蛋白中对磷酸化的丝氨酸进行光切割。研究人员随即想到,可以合成一个包含特异性磷酸化位点的标签,使其与固化的铀酰离子结合,该系统可以在光切割后释放出纯化的无标签重组蛋白。

  Møllegaard决定先将这一系统开发成为C端标签,因为此前的工作显示铀酰切割发生在磷酸化丝氨酸的N端,这样就可以实现C端标签的完全切除。蛋白酶剪切无法完全去除这样的标签,因为它的剪切发生在识别位点的C端。

  研究人员选择酪蛋白激酶CKII作为磷酸化标签肽段的激酶,因为这种酶的磷酸化发生在识别序列N端的丝氨酸上。他们设计的标签序列是SSDDD,其中三个天冬氨酸负责与铀酰结合,两个丝氨酸作为磷酸化位点。

  研究人员将该标签的 C端与GFP融合,并在细菌中进行表达,随后他们用CKII处理细菌的裂解物。研究显示,磷酸化只发生在标签中的丝氨酸位点上。在与铀酰 -NTA-琼脂糖珠混合时,磷酸化的GFP-tag与琼脂糖珠发生了有效的特异性结合,而这样的结合可以被磷酸钠缓冲液洗脱。

  为了研究铀酰切割的具体情况,研究人员在细胞裂解物中对GFP-tag进行了CKII处理,然后在溶液中加入铀酰,并进行了UV照射。他们观察到,蛋白标签出现了光依赖性的切除。不过ESI-MS显示,GFP的最后一个赖氨酸也被切掉了,说明该系统还需要进一步优化,让剪切位点更为精确。

  现在,Møllegaard正在尝试对结合在铀酰 -NTA-琼脂糖珠上的融合蛋白进行光切割,以便将其发展成为蛋白分离和标签切除的一步法系统。“还有许多步骤有待优化,举例来说,我们需要优化紫外线照射,以便在纯化柱上进行更有效的光切割,”Møllegaard指出。