【讨论帖】Ni柱纯化蛋白结果，敬请批评。

最新回复

• moonlight45 (2013-5-13 16:53:36)

  这样的结果做单抗恐怕不行。
  增加washing buffer 的量，延长洗涤时间或增加咪唑浓度。

• finger (2013-5-13 16:54:07)

  
  我给你发了份相关的材料，包括不同金属粒子的选择性和分离效果，只在做试验的时候把一般的缓冲液换成8M脲或者6M盐酸胍即可，以前也遇到有人问这个问题，它参照这个材料的方法就没事了，其实纯化没有那么简单，照规程一定能做好的，我们最近经常做带his标签蛋白纯化，无论是包涵体还是别的都没有问题。

• fei1226com (2013-5-13 16:54:36)

  
  Ni柱纯化少量目的蛋白,已经进行了两次都含有很多杂带,想问问有那些原因?

• summerxx (2013-5-13 16:55:46)

  
  你可以在后面增加一步离子交换能达到不错的效果

• orangecake (2013-5-13 16:56:09)

  非特异性结合为主要原因，可以增加一些表面活性剂，同时可以尝试一下不同的金属离子和洗脱方法，比如ph梯度洗脱，有时候固定化金属螯合层析不是我们想象的那么好，很多人遇到过这样的问题，也有很多人提过，其实可以看出并不是所有的蛋白都适合这个表达体系。

• IAM007 (2013-5-13 16:56:28)

  
  虽然你用的Ni柱是亲和纯化，但是并不是说亲和纯化一步就能得到非常纯的蛋白，一般都要加一些其它的分离纯化步骤,想你这样的结果，只通过改变Ni柱的分离纯华条件可能很难有大的突破.你可以根据你的蛋白的等电点增加DEAE或是sp柱子，或者考虑别的柱子！祝你成功！

• ero11 (2013-5-13 16:56:49)

  
  其实分离的好坏关键看分离条件，在金属螯合层析其实可选择:镍，铁，钴，铜，锌钙等离子，每种选择性都不同，洗脱的条件也是很有讲究的，包括重组蛋白HIS标签的位置都有很大的影响，因此其实没有哪种纯化是可以象试剂盒上写的操作规程那么简单。

• ero11 (2013-5-13 16:57:21)

  
  试试提高一下你的lysis buffer中的imidazole的浓度，从10mmol/L试起，包括20mmol/L、甚至可以到30mmol/L。这样柱子的特异性会提高些，但是，你的目的蛋白可能要损失大一些。对了，目的蛋白与柱子结合的时候最好不要用过柱的形式，把含有目的蛋白的细胞裂解液与柱子颗粒一起放在小锥形瓶中，用摇床孵育1h左右，然后再装柱洗脱，这样可能会好一些。仅供参考！

• yueban-1147 (2013-5-13 16:57:51)

  试试提高一下你的lysis buffer中的imidazole的浓度，从10mmol/L试起，包括20mmol/L、甚至可以到30mmol/L。这样柱子的特异性会提高些，但是，你的目的蛋白可能要损失大一些。对了，目的蛋白与柱子结合的时候最好不要用过柱的形式，把含有目的蛋白的细胞裂解液与柱子颗粒一起放在小锥形瓶中，用摇床孵育1h左右，然后再装柱洗脱，这样可能会好一些。仅供参考！
  
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  关于NI与目的蛋白结合的时间，我有些疑问：Protocol上讲Ni与HIS TAG的结合能力强与抗原抗体反应，我因为作流式较多，知道一般的抗原抗体反应30min就可以得到很好的效果。而Protocol也说反应15-60min。是不是反应的时间过长会造成非特异性结合？一般的反应有必要反应到60min吗？是不是20min就可以了，这样反而可以减少非特异性结合。

• 如影随形 (2013-5-13 16:58:32)

  我给你发了份相关的材料，包括不同金属粒子的选择性和分离效果，只在做试验的时候把一般的缓冲液换成8M脲或者6M盐酸胍即可，以前也遇到有人问这个问题，它参照这个材料的方法就没事了，其实纯化没有那么简单，照规程一定能做好的，我们最近经常做带his标签蛋白纯化，无论是包涵体还是别的都没有问题。
  
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  谢谢大侠的指教。我阅读您给我的信件。不过有个 问题。我发现您给的说明书上的SDS－PAGE结果也不是很纯。不知道诸位觉得是不是这样的结果就是很好的结果了。

  
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• summerxx (2013-5-13 16:59:02)

  
  这个看你的需要，这样的纯度做抗体和做活性都没有问题了，而且我们做这个实验的时候是帮忙做的，只用了三天，纯度大于90%应该没有问题，而且收率在65%左右，这个是别人要的新基因表达的蛋白，所以看什么需求，当然如果你需要纯度特别高，那就还需要更精细的条件，当初我们只用三天完成了这个别人花了几个月没有做好的纯化，而他们是用进口的钴螯合介质，我们用的是自己的产品。

• 如影随形 (2013-5-13 16:59:21)

  
  NI-NTA的重复利用：
  文献上将，NI-NTA可以反复应用5次，直到resin的颜色由蓝色变为brownish－gray。然后就需要再生了。
  不知道各位在应用时是不是如文献上所述？重复利用时有什么注意的事项吗？是不是重复利用柱结合蛋白的能力会随重复利用的次数增加而下降？

• junhun (2013-5-13 16:59:43)

  
  可以重复使用，其实就和别的柱子再生一样，然后再用EDTA洗去金属离子，然后洗掉EDTA，再螯合金属离子，这样就可以，我觉得其实有时候用完一次就最好再生一次，这样好保持最佳的分离效果和最好的重现性。需要注意的是样品最好要处理干净，特别是脂蛋白和糖蛋白包括核酸等这样的物质过多会使介质结块，从而影响介质的分离效果。

• vivian4123 (2013-5-13 17:00:10)

  NI-NTA的重复利用：
  文献上将，NI-NTA可以反复应用5次，直到resin的颜色由蓝色变为brownish－gray。然后就需要再生了。
  不知道各位在应用时是不是如文献上所述？重复利用时有什么注意的事项吗？是不是重复利用柱结合蛋白的能力会随重复利用的次数增加而下降？
  
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  1 重复利用可以,但是只能做同一种蛋白,不可以混用
  2 重复利用结合力肯定降低,而且经常做不出来,包括回收的.纯化后蛋白含量可以忽略不计!而且回收较麻烦,尽可能不用算了.

• orangecake (2013-5-13 17:00:31)

  
  有一次我的纯化结果也是这样，后来发现是ni过量所致。加大了菌液量后就好了，可以再用sephdexG25柱脱盐一次，蛋白的损失量是很大，但是值得！我用的ni都没有再生，主要是怕掌握不好再生的技术，看说明书要用各种浓度的乙醇和niso4，EDTA洗来洗去，很惭愧，还好老板也认为再生了可能吸附量就不行了。NI纯化的起始应该是QIAGEN公司的包装好一些，NOVAGEN等其它公司也多来源以此。

• junjie05 (2013-5-13 17:00:51)

  
  其实纯化关键是介质，只要螯合好了镍离子的柱子，差别都不是很大，最有意思的是不少人做纯化一旦做不好就怀疑介质不好，我们一直用自己的产品，而且也重复使用，没有任何问题，我们最近准备制备1-2g带HIS标签的蛋白，25ml要近4000元，我觉得太贵了。

• idea2011 (2013-5-13 17:01:12)

  
  我在尝试用Ni-柱纯化并复性包含体蛋白，洗脱下来的目的蛋白条带很淡。（咪唑浓度为100mM）
  另外我们实验室用的是invitrogen的ProBand Ni-树脂，参照说明书进行柱的再生，总是洗得不是太干净。（用EDTA,NaOH和NiCl2再生）
  请大家多提意见！：）

• S6044 (2013-5-13 17:01:32)

  
  我想问:裂解前加lysis buffer和TE有什么区别,lysis buffer加的量对纯化有有关系吗,还有蛋白酶抑制剂的量

• xueyouzhang (2013-5-13 17:04:19)

  我前一段时间用镍柱纯化蛋白，第一次用的是咪唑洗脱，效果很不好，第二次换用pH浓度洗脱，比咪唑好多了，我本来还觉得不太满意，看了chromatography的洗脱图以及讲解，觉得自己的纯化效果对于以后的应用来说足够了。所以建议正在纯化的园友，可以多试试几种纯化方法，不一定非用咪唑或pH，我试过二者混用，证明对我的蛋白来说，混用的效果并不比单用pH效果好，但二者的效率是1+1>2的。也不知道混用有没有什么不良后果，请教

• junjie05 (2013-5-13 17:04:46)

  我没有做过混合的办法洗脱，但是给我一个很好的启发，我一般不用pH洗脱主要原因是怕pH太低金属离子会掉下来，干扰活性或难去除，此外还有个顾虑是如果是分离活性蛋白怕失活，也就这两点吧，但是一般pH4.5以上金属离子该是不会掉的，而且我觉得咪唑200mM-500mM洗脱干扰太大，很容易掩盖了蛋白峰，特别是不好的咪唑，吸收很大，所以建议用那种针状结晶，而且非常白的，这样的咪唑吸收少。混用没有什么不良效果，此外我试验表明如果在洗脱中加非常少的土温就可以降低杂吸附，分离效果更好，洗脱的峰更纯。