【求助】PCR 产物电泳拖尾严重

字体: 小中大 | 打印发表于: 2015-8-29 16:06 作者: 了了来源: 分析测试百科网

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【求助】PCR 产物电泳拖尾严重

尊敬的各位：
您好！

请教一个问题：
我扩增的PCR产物电泳结果如图，拖尾严重！！
唉！
请赐教！

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【求助】PCR 产物电泳拖尾严重

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最新回复

气泡 (2015-8-29 16:06:34)

实在是太夸张了~~~
能不能说明一下你扩的样以及条件？
dior (2015-8-29 16:06:57)

不知道你做的是单纯的PCR，还是RT-PCR：
如果是RT-PCR，可能是反转录酶失效或者活性不好了，mRNA没有完全转录成cDNA，mRNA跑出来不就是拖尾嘛？
看看是不是引物降解了，这样也会产生拖尾
其它的就是减少dNTP，提高退火温度，适当降低模板浓度，作个Mg2+梯度试试。
还有就是加点增强剂DMSO，据说有效，这个我没有试过
园丁## (2015-8-29 16:09:32)

模板量太多,提高退火温度
panda王 (2015-8-29 16:14:42)

除了拖尾，你的目的带位置应该正确吧，那么PCR结果还不是太郁闷啊！关键是去掉非特异扩增。有以下几个建议供参考：
1.此次电泳明显上样量太多，可适当减少，易于观察。
2.你上样时一个泳道换一个枪头还是用一个枪头，如果是后者，尽量多吹吸几次，感觉好像有污染（不一定是）。
3.每个PCR体系中有蛋白污染的可能吗？因为有的泳道好像有东西没跑下来，由于蛋白和核酸的作用力可导致拖带。
4.PCR的退火温度适当可以提高一些以减少引物和模板的非特异结合。
5.减少PCR体系的模板量。
6.用热启动PCR试试。
7.体系中加些减少非特异结合的试剂。我们实验室用的是胶体金，效果很好。
另外，那个DMSO主要是阻止核酸形成二级结构的，如发卡等，如果PCR产物目的带前面距离很近的位置有较强的带，有可能是模板二级结构的影响，加DMSO可能消除，但我们做过，效果不是很好，目的带和其前面的带都变弱了，怀疑其抑制了酶的活性，反而加甜菜碱（作用同DMSO）的效果好。不过，看楼主的PCR产物这个问题可以先不考虑：）
祝你好运！
祝大家新年好心情！
小鱼鱼 (2015-8-29 16:15:31)

是上海交大的吧？胡钧实验室发表了一篇很有影响的文章，也是关于用胶体金抑制pcr非特异性扩增的。
了了 (2015-8-29 16:16:06)

尊敬的各位：
我首先感谢大家！
我采纳了大家的建议，作了如下调整：
1. 提高退火温度，由53℃提高到55℃；
2. 降低模板量。
第一次做，确实收到了效果，大家看看！进步很大。还算很好！
可是问题又有了。大家看我的下面一个帖子。条带没有了。
补充一下，我做的是普通的PCR，不是RT—PCR。

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了了 (2015-8-29 16:16:22)

但是，当我做第二次的时候，就成了这个样子，两侧的是Marker，大家看看。是怎么回事？我没有变什么条件呀？难道是电泳也和琼脂糖胶的问题？？

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newway (2015-8-29 16:18:10)

可以肯定的一点的是胶没倒好，因为Marker没跑好
其他问题暂时不好说
但最有可能的是：
这块胶太薄了，仔细看，胶的两侧有点儿东西，因为倒胶时，四周胶的厚度总是要比中央厚一点（物理现象），你上样时，样品还能呆在孔中，跑胶的时候，由于中间胶比较薄，DNA样品及一部分Marker就跑的电泳液里了，只有两侧Marker的一部分由于胶比较厚而留下。
不排除Loading Buffer没加好导致DNA样品扩散到电泳液中（可能性较小）
总之就是样品没进胶，不能说明你PCR的结果
qqq111 (2015-8-29 16:18:29)

我估计是胶的问题，但主要的不是胶的问题，Marker没有跑好是胶的问题，但是你样品区根本就没有什么带，估计是你所用的试剂已经交叉污染了，建议你用一套新的试剂来试试。
了了 (2015-8-29 16:18:49)

哈哈哈哈哈哈哈..............................
谢谢大家！！谢谢。！！！
在大家的帮助下，我已经做好了。特地来感谢！！！
我寒假不回家了。就做试验！！
大家看看我的电泳！！好了！

[ 本帖最后由了了于 2015-8-29 16:20 编辑 ]

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二丫头466 (2015-8-29 16:22:49)

说真的看了你的图发觉你电泳都存在很大问题啊　电泳液换一下,胶做好了放半小时为好.电压不要一会大一会小，条带太难看了，楼上的river640说的很有道理
看你的拖尾我想你可以把模板量稀释一倍
其他的没什么问题的
txwuyan (2015-8-29 16:23:10)

我觉得你现在的电泳图还是不太好，条带过亮，固然与你过度暴光有关，另外可能PCR是模板浓度太高，或者有蛋白质污染，前者建议稀释模板为1：20，甚至1：50，后者可用紫外分光光度仪测一下就知道了！！
了了 (2015-8-29 16:47:46)

QUOTE:
原帖由 txwuyan 于 2015-8-29 16:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
我觉得你现在的电泳图还是不太好，条带过亮，固然与你过度暴光有关，另外可能PCR是模板浓度太高，或者有蛋白质污染，前者建议稀释模板为1：20，甚至1：50，后者可用紫外分光光度仪测一下就知道了！！ ...
您说什么“使用紫外光分光光度仪”可以测得蛋白质？为什么？？
summerxx (2015-8-29 16:48:58)

分子量标准加的量太多
dog002 (2015-8-29 17:08:34)

楼主电泳上样量偏大了，一般用5ul PCR产物就够了，此外电压不要太高，高了虽然跑的快，不过跑出来的带就不好看，还有就是没必要跑的这么长，要是怕跑不开，胶的浓度可以提高点，比如2％。
kewanqi2011 (2015-8-29 17:09:33)

怎么看你的电泳图都不是很漂亮，先问一下，你的胶是百分之几的？是用TAE配的吧？这个看上去怎么跟有一次用水配的胶跑出来的条带差不多啊？呵呵。
了了 (2015-8-29 17:10:04)

谢谢您！我使用的是TBE。
dhpbj (2015-8-29 17:10:59)

建议用百分之二的胶
会好很多
你这可能是百分之一的吧
了了 (2015-8-29 17:13:44)

您是对的，确实是1%的胶。感谢您！同时也佩服您的学识！我对您的景仰，有如滔滔江水，连绵不绝；又如黄河泛滥，一发而不可收拾。
dhpbj (2015-8-29 17:14:20)

是不是好多了
漂亮多了
哈哈
我都是用百分之二的胶，除非是DNA样品检测才会用百分之一的