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【求助】用pet28a表达不出蛋白]

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-3-27 15:37    作者: rxcc33    来源: 分析测试百科网

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【求助】用pet28a表达不出蛋白]

最近构了一批载体，分别用不同基因片段连到pet28a上。用来原核表达，却怎么也表达不出来。试过不同的iptg浓度以及温度，都没有效果。而且我想那么多载体，连的不同的基因，在同一个条件下怎么一个都表达不出来呢。别人一搞就出来，我死活弄不出来，郁闷啊。
我的操作流程是挑单菌落，接到2ml相关抗性的lb，过夜培养。第二天取60ul接到3ml的lb中，长到od600为0.5-0.6时（因为是新手，取一ml去测浓度了），从中取出1ml（还剩1ml做对照），加iptg（manual上说是到1mM，我也试过不同的浓度，比如0.5mM），继续诱导（温度37，我也试过28，20）3个小时以上(久一点应该没有影响吧)，然后收集对照和诱导后的菌体，加loading buffer，沸水煮几分钟，离心，取上清上样。请大家帮我看看问题出在哪啊。
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最新回复

  • yonger (2014-3-27 15:37:49)

    如果确定载体真的构建成功了，恐怕就是生成包含体了。建议把破壁后沉淀也跑一下电泳，看看是否有目的条代。

  • yonger (2014-3-27 15:38:12)


    而且有的时候，诱导表达的蛋白可溶性部分不多，
    SDS-PAGE看不出来。

  • rxcc33 (2014-3-27 15:38:30)


    哦，那样啊。其实如果我就一个载体表达不出来的话我也就认了，但是一堆载体都表达不了，就让我怀疑是不是我的操作还是什么试剂有问题了，所以我把我的操作过程都列出来，让大家帮我看看有没有问题。

  • fsdd817 (2014-3-27 15:42:17)


    你构建表达载体后，是否测序确认了，读码框是否正确？

  • flower-201 (2014-3-27 15:42:55)

    你的操作条件都没有什么问题！你所说的温度，IPTG浓度以及诱导时间都是最常规的条件！
    最可能怀疑的地方在你的操作过程中，没有保持无菌，造成有杂菌污染！或者在培养基中没加入kana！
    建议你重新涂平板，挑取单克隆，进行诱导表达，条件不用变！同时送菌测序！确定你是否真的把目的基因转进去了！

  • yjf1026 (2014-3-27 15:43:14)


    我也在做pET28a表达,若测序正确,我觉得你应该检查一下你的loading buffer,因pET28a在37度表达量是很大,易形成包涵体,而loading buffer在低温条件下SDS会析出,如未混匀就吸取上清的话,loading buffer中因无SDS而难以溶解包涵体,经离心后包涵体会沉淀至管底,上清电泳就无法检出表达的目的蛋白了.如样品沸水煮后离心之后管底的沉淀明显多于空白对照则十有八九是形成包涵体而loading buffer中无SDS所致.另外沸水煮的时间长一点,如15-20分钟试试!
    仅供参考!!

  • rxcc33 (2014-3-27 15:43:35)

    谢谢大家帮我分析。
    因为本室有测序仪，因此我对其中2-3个测过序，读码框是没有问题。我在前引物中加入的是nheI和ndeI，都是直接跟atg即可的吧。

  • 3648755 (2014-3-27 15:46:11)


    1.你的基因是来源于原核还是真核？可以考虑一下稀有密码子的问题。
    2.并不是所有转化表达载体后长出的转化子都可以表达，你可以多挑几个一起诱导看看。

  • rxcc33 (2014-3-27 15:46:55)

    QUOTE:

    原帖由 3648755 于 2014-3-27 15:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    1.你的基因是来源于原核还是真核？可以考虑一下稀有密码子的问题。
    2.并不是所有转化表达载体后长出的转化子都可以表达，你可以多挑几个一起诱导看看。 ...
    我没有考虑稀有密码子呢，影响会很大吗
    你的第二点也没有考虑到。但是我同时做多个载体的表达，都弄不出来。而且其中一个蛋白别人用其他载体表达过，表达出来了，对宿主有毒性；我自己诱导，也看得出诱导后菌颜色变暗，感觉也是有毒性的样子。

  • rxcc33 (2014-3-27 15:48:03)


    再请教大家大家一个问题，我发现加iptg诱导后的菌很臭，恶臭，跟没有诱导前的大肠杆菌闻起来不一样，正常吗？大家也没有发现这样的现象？

  • rxcc33 (2014-3-27 15:48:28)

    我也在做pET28a表达,若测序正确,我觉得你应该检查一下你的loading buffer,因pET28a在37度表达量是很大,易形成包涵体,而loading buffer在低温条件下SDS会析出,如未混匀就吸取上清的话,loading buffer中因无SDS而难以溶解包涵体,经离心后包涵体会沉淀至管底,上清电泳就无法检出表达的目的蛋白了.如样品沸水煮后离心之后管底的沉淀明显多于空白对照则十有八九是形成包涵体而loading buffer中无SDS所致.另外沸水煮的时间长一点,如15-20分钟试试!
    仅供参考!!
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    我觉得有点道理。loading buffer室温下放了1年多了，我今天重新配了一下，明天重新诱导了在看看。祝我好运，呵呵

  • sunnyB (2014-3-27 15:49:05)


    还有不知道你的基因上稀有密码子是不是很多，如果是，换个宿主菌试试

  • rxcc33 (2014-3-27 15:49:39)


    哎，看来不是loading buffer的问题。我用重配的loading buffer煮了15分钟，还是没点东西。。

  • DONT (2014-3-27 15:52:09)

    你有没有把沉淀和上清都跑胶看看.形成包涵体的可能性很大.另外,你可以试以下超声破菌,释放出里面的蛋白,再进行煮样电泳.

  • yonger (2014-3-27 15:52:27)


    好像加入IPTG后没有恶臭味啊，至少我的重组蛋白就没有。

  • gemei0115 (2014-3-27 15:55:38)


    如果阅读框对，细胞有没有用对啊？pet28a要用T7 promoter的，若转的DH5α永远也不会表达，里面没有质粒的promoter，换一个细胞试试，我也是用的这个质粒，没问题。

  • shenkunjie (2014-3-27 15:55:55)


    换个宿主菌试试

  • c86v (2014-3-27 15:57:08)

    你挑的单克隆有没有问题啊？要鉴定一下哦

  • laughing妹 (2014-3-27 15:57:32)


    很简单,找个阳性plasmid 对照,就知道问题在那,pET28a 只有NcoI和NdeI .

  • BOSS2011 (2014-3-27 15:57:49)

    表达蛋白和基因克隆可以是同一个宿主菌，也可以是不同的宿主菌。PET载体对应的表达菌柱是BL－21（DE－3）吧？如果用普通的DH5a可能是检测不到表达条代。
    另外IPTG诱导我们通常是做4、5、6小时的比较，我认为IPTG诱导至少要4个小时才能检测到蛋白表达，通常5个小时左右有高效表达。
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