氨基酸自动分析仪法

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氨基酸自动分析仪法
  关键词:标准物质 食品成分检测 化学试剂 分析试剂
  1.原理
   食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸,经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后,与茚三酮溶液产生颜色反应,再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。可同时测定天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等16种氨基酸,其最低检出限为10 pmol。
  本法为GBT14965—1994食物中氨基酸的测定方法。适用于食物中的16种氨基酸的测定。其最低检出限为10 pmol。本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定。
  2.仪器
  ①真空泵。
  ②恒温干燥箱。
  ③水解管。
  ④耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管,体积20~30 mL。
  ⑤真空干燥器(温度可调节)。
  ⑥氨基酸自动分析仪。
  3.试剂
  全部试制除注明外均为分析纯,实验用水为去离子水。
  ①盐酸:优级纯。
  ②6 mol·L-1HCl:浓盐酸与水l:1混合而成。
  ③50%的氢氧化钠:称取100 g Na()H溶解在100 mL水中。
  ④苯酚:需重蒸馏。
  ⑤混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售):O.0025mol·L-1。
  ⑥缓冲液
   a.pH 2.2的柠檬酸钠缓冲液:称取19.6 g柠檬酸钠(Na3C6H2O7·2H20)和16.5 mL浓盐酸混合,加水稀释到1 000 mL,用盐酸或50%的NaOH溶液调节pH至2.2。
   b.pH 3.3的柠檬酸钠缓冲液:称取19.6 g柠檬酸钠和12 mL浓盐酸混合,加水稀释到1000 mL,用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至3.30。
    c.pH 4.0的柠檬酸钠缓冲液:称取19.6 g柠檬酸钠和9 mL浓盐酸混合,加水稀释到1 000 mL,用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。
   d.pH 6.4的柠檬酸钠缓冲液:称取19.6 g柠檬酸钠和46.8 g氯化钠(优级纯),加水稀释到l 000 mL,用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至64。
  ⑦茚三酮溶液
   a.pH 5.2的乙酸锂溶液:称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168 g,加入冰乙酸(优级优)279mL,加水稀释到1 000 mL,用浓盐酸或50%的。NaOH调节pH至5.2。
  b.茚三酮溶液:取150 mL二甲基亚砜(C2H。OS)和乙酸锂溶液50 mL,加入4 g水合茚三酮(C9H4O3·H2O)和0.12 g还原茚三酮(C18H10O6·H2O),搅拌至完全溶解。
  ⑧高纯氮气:纯度99.99%。
  ⑨冷冻剂:市售食盐与冰按1:3混合。
  4.操作步骤
  ①样品处理:样品采集后用匀浆机打成匀浆(或尽量将样品粉碎),于低温冰箱中冷冻保存。分析使用时将其解冻后使用。
  ②称样:准确称取一定量样品,精确到0.000 1 g。均匀性好的样品如奶粉等,使样品蛋白质含量在10~20 mg范围内;均匀性差的样品如鲜肉等,为减少误差可适当增大称样量,测定前再稀释。将称好的样品放入水解管中。
   ③水解:在水解管内加入6 mol·L-1盐酸10~15 mL(加酸量视样品蛋白质含量而定),含水量高的样品(如牛奶)可加入等体积的浓盐酸,加入新蒸馏的苯酚3~4滴,再将水解管放入冷冻剂中,冷冻3~5 min,再接到真空泵的抽气管上,抽真空(1 333.22~2 666.44Pa),然后充人高纯氮气;再抽真空充氮气,重复3次后,在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖。将已封口的水解管放在(110±1)℃的恒温干燥箱内,水解22 h后,取出冷却。
  打开水解管,将水解液过滤后,用去离子水多次冲洗水解管,将水解液全部转移到50 mL容量瓶内,用去离子水定容。吸取滤液1 mL于5 mL容量瓶内,用真空干燥器在40~50℃干燥,残留物用1~2 mL水溶解,再干燥,反复进行2次,最后蒸干,用1 mL pH 2.2的缓冲液溶解,此液为样品测定液,供仪器测定用。
   ④测定:准确吸取O.20 mL混合氨基酸标准,用pH 2.2的缓冲液稀释到5 mL,此标准稀释液浓度为5.00 nmol·(50µL) -1外标法测定样品测定液的氨基酸含量。
  ⑤允许差:同一实验室的平行测定或连续两次测定结果相对偏差绝对值≤12%
  5.测定条件(以Deckman 6300型氨基酸自动分析仪为例)
  缓冲液流量:20 mL/h;
  茚三酮流量:10 mL/h;
   柱温:50℃、60℃和70℃;
  色谱柱:20 cm;
  分析时间:42 min。
  6.计算
    上机样品液(50µL)中氨基酸量(nmol)=上机标准液(50μg)中氨基酸(nmol)×样品峰面积/氨基酸标准面积 
  所以  X=上机样品液中氨基酸总量[(nmol)×f×Mr×100]/(m×V×106)
  式中:X——样品中氨基酸含量,mg·(100 g) -1;
         f——样品的稀释倍数;
        Mr——氨基酸的相对分子质量;
         m——样品质量,g;
         V——上机时的进样量(此处为50肚I。)。
  7.说明
  样品中氨基酸的含量在1.00 g·(100 g) -1以下,保留两位有效数字,含量在1.00 g·(100 g) -1以上,保留三两位有效数字。
  ②16种氨基酸相对分子质量;天冬氨酸:133.1,苏氨酸:119.1,丝氨酸:105.1,谷氨酸:147.1,脯氨酸:115.1,甘氨酸:75.1,丙氨酸:89.1,缬氨酸:117.2,蛋氨酸:149.2,异亮氨酸:131.2,亮氨酸:131.2,酪氨酸:181.2,苯丙氨酸:165.2,组氨酸:155.2,赖氨酸:146.2,精氨酸:174.2。

[ 本帖最后由 标物中心 于 2014-4-18 20:51 编辑 ]
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