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【求助】RT-PCR一步法好还是两步法好?
请问【求助】RT-PCR一步法好还是两步法好?
1.RT-PCR一步法好还是两步法好?
2.有没有人用过Access RT-PCR系统,请介绍一点经验!
3.我看过DXY的一些帖子,现在头都大了,RT-PCR到底能不能定量?怎样做才可以达到半定量?
4.我不知道该买多大的试剂盒,有哪位高手帮忙预算一下经费,和试剂盒的次数?优化的过程好像要花费很大的精力和试剂.
5.能否帮忙预算一下从RNA提取到RT-PCR全过程的经费预算?
谢谢各位大侠,我的问题很菜吧!!
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最新回复
王六六 (2016-4-08 09:04:57)
3.RT-pcr做半定量不准确,要不断地优化条件。最好实时荧光定量PCR。
4.5. 经费和你的标本量有关。TRIzol 100ml 1500左右,RT-PCR试剂盒100T好的要7000多,稍次一点的4000多,再差的用国产的几百,再加上琼脂糖,marker等,就一万五吧。PCR的优化过程可以买Takara或Promega的酶,比较经济实惠。
ztonyc (2016-4-08 09:05:15)
一步法
优点:简单,方便。
缺点:灵敏度要比两步法低。不适合PCR初期条件的摸索,出了问题之后不能够很好的找到原因。
两步法
优点:灵敏度要比一步法高。在初期摸索PCR条件时,可以很容易找到问题所在。还有更为关键的一点是,做两步法可以节约monney,特别是宝贵的反转录酶,把反转录体系分开做,一次的转录产物可以多次用来做PCR,非常适用于摸索PCR条件。
缺点:麻烦。
故,如果你在PCR初期建议用一步法。如果你的条件摸索成熟,建议用两步法。
coolcool (2016-4-08 09:05:29)
另外,如果你打算定量,最好还是用一步法,分为两步操作,就增加了出现误差的机率,另外,每一部的效率不同也能影响结果。最好同时加上一个看家基因作为内参,这样半定量更可靠一些。
Promega的Access RT-PCR System (A1250)我用过,效果不错,3000元左右,50微升的体系可以做一百次,当初为了省钱,每次都是做30微升的体系,可以多做很多次,至于具体的用量就要看你的样本量和实验进展了,如果你的引物设计的比较合理,实验室有些相关经验的话,摸条件应该不是很难。(我当初就是用这个直接加SYBR Green I做的荧光半定量。)
至于RNA的抽提,你可以买试剂盒,也可以用TRIzol 提取,看经费情况吧,前者省事些。
爱老虎游tt (2016-4-08 09:05:49)
感谢各位大侠的执教,小弟受益匪浅!
我的经费很有限,我想根据文献的条件进行试验,实在不行再优化,不知大家是否赞同?
eor (2016-4-08 09:06:05)
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/373634_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/373637_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=373638&sty=3&keywords=Access+RT-PCR')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/275824_0.html')
效果不错,就是比较浪费一点,不过大批量样本做起来很爽呀。
zhy平平 (2016-4-08 09:06:29)
QUOTE:
笨笨的问问,Access RT-PCR就是一步法RT-pcr吗?爱老虎游tt (2016-4-08 09:06:58)
QUOTE:
感谢!你提供的联接非常有用!!我想根据文献的条件(别人的优化条件)进行实验,实在不行再优化,不知大家是否赞同,因为我感觉RT-PCR麻烦就麻烦在优化条件这一环节,也很浪费试剂,毕竟我们的经费太有限了,再者我们实验室没有PCR仪,到别人那里去蹭遭白眼的感觉真是很难受!!
uaubc (2016-4-08 09:07:15)
根据文献的条件(别人的优化条件)进行实验,实在不行再优化,是可以的,就是一定要注意加样的量一定要精确。
祝你们成功!
3.14 (2016-4-08 09:07:32)
好,我也要做基因的定量,想做competitive RT-PCR, 不知哪位前辈做过给点建议
eor (2016-4-08 09:08:00)
QUOTE:
一步法和二步法各有优缺点。二步法RT-PCR :
(1)可使用oligo(dT),随机六聚体引物或基因特异性引物进行第一链合成。
(2) 高灵活性:可选用不同的酶系统。
(3)可优化困难的RT-PCR反应
(4)可实现长模板mRNA的转录扩赠(使用ELONG ASE Enzyme Mix) 。
(5)最适用于克隆产物(使用高确限度酶或混合酶) 。
一步法RT-PCR:
(1)第一链合成时只能使用基因特异性引物。
(2)高灵敏度:使用预混合的SUPETSCRIPT H和Taq聚合酶,可检测到低至0.1pg的mRNA。
(3)高便利性:所使用的酶已经预混合。移液步骤少,减少污染机会。
(4)产物长度,<3KB。
(5)最适于大量样品的分析
您可以根据你实验的要求来定。实验的经费我觉得买RT-PCR试剂盒可以先买一个25次的盒子试试,也就是1700—3000元左右,说不定你做熟了可以将反应体系减少一半,就相当于50次的了。
INK (2016-4-08 09:08:15)
uaubc (2016-4-08 09:08:38)
什么又叫两步?
谢谢,不吝赐教!
yhn (2016-4-08 09:08:55)
【求助】RT-PCR一步法好还是两步法好?