【求助】哪些条件可能造成本来可溶的重组蛋白表达形成...


我有一个别人已经构建好的大肠杆菌菌株,表达单链IgG抗体。人家表达的时候目的蛋白是以可溶形式表达,我用同样的条件重复操作,结果表达蛋白始终在沉淀中,不知道是什么原因造成的。表达条件如下:
1.30C,50ml 2*YT+Amp+Chl+1%葡萄糖,过夜培养,至OD600为1.4左右
2.3000rpm 离心10min收集菌体后,用25ml 2*YT+Amp+Chl重悬菌体,加入1mM IPTG 30C诱导4小时。
3.3000rpm 离心10min收集菌体,加入2.5ml Novergen公司的Bugbuster破碎液室温破碎细胞1小时。
4. 4C,18000rpm离心40min 收集上清,用2.5ml PBS重悬沉淀,上清、沉淀同时跑SDS-PAGE和Western检测,蛋白条带在沉淀中。
由于是人家已经研究过的条件,因此我目前都只是做重复。对于试验中的操作我有几点疑问:
1.诱导前OD值过高是否有影响,我也曾经做过过夜只有0.8左右的,结果一样。
2. 我使用的培养基PH为7.0,但是过夜培养后检测PH为5.5。我用的 是Oxid的培养基,连NaCl和葡萄糖都换成Sigma的了。对方用的是Difco的培养基。
请大家帮忙分析一下

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  • huifeng0516 (2014-4-21 16:17:10)


    很可能的,影响因素太多,不同实验室并不是太容易完全重复,比如连用水都不一定一样吧,应该需要重新摸索。培养基有很大影响、OD也是
  • PINK (2014-4-21 16:17:30)


    诱导前OD可能会影响表达量的高低,但是对蛋白表达的形式影响不是很大。与发酵不同,在摇瓶培养的时候一般都是忽略pH变化的,所以我感觉pH变化的影响也不大。
    不知楼主诱导温度和转速是多少,如果想使可溶性表达最大化,主要采用的就是降低诱导温度和转速,你可以用不同的诱导温度做个对照;你应该再咨询一下他们破菌的条件,也许是你的破菌条件不同,使得可溶性表达的蛋白也留在沉淀中,使你误认为是包涵体表达了。
  • junhun (2014-4-21 16:18:06)

    我现在的培养用的物质全都是进口试剂了,水也换成超纯水了.
    温度目前我做到30度,
    破碎条件用过细胞破碎仪破碎做对照
    所有结果都不理想, 真是郁闷啊
  • bamboo16 (2014-4-21 16:18:25)


    蛋白表达影响因素确实非常的多,用Bugbuster是最温和的细菌破碎方法,也非常贵,你可以先用少量细菌(1ml)进行破碎研究,确定蛋白表达情况后再大规模裂解,对于可溶性表达,不同实验室条件不一样,建议你自己摸索一下,注意以下几点:
    1:细菌要重新转化的,在平板上生长不超过24小时
    2:诱导OD你采用0.6,太高不是很好。操作过程:过夜培养2ml细菌(多选几个克隆,培养液里含葡萄糖),12小时--16小时后1/100转接到50ml培养基(不含葡萄糖),220rpm37度培养3到4小时,OD0.6左右,冷却细菌致20度,加IPTG , 在20--25度诱导,Bugbuster破菌,电泳检测
  • 49888 (2014-4-21 16:18:59)


    相关疾病:
    营养过剩
    高温,过表达,营养过剩这3个应该是主要原因
  • junhun (2014-4-21 16:19:22)


    谢谢各位.
    我的均是人家已经构建好,经过表达纯化无问题后拿过来的,我的诱导条件也是采用他们已经研究好了的.但是现在就是无法重复
    我现在设计实验降低温度和IPTG浓度看一下结果,具体结果尽快向大家汇报.
  • mamamiya (2014-4-21 16:19:45)


    呵呵,我的理解,你把培养基中的葡萄糖改成2g/l葡萄糖,或者不用葡萄糖培养到OD=1.0左右,进行诱导,培养4~8小时后测定表达
    因为培养基中含有1%葡萄糖也就是10g/l葡萄糖,浓度太高,在摇瓶条件(通氧以及搅拌)条件下,葡萄糖是消耗不完的,因为很容易产生葡萄糖效应,因此你的发酵液的pH为5.5,产生的乙酸会抑制你的菌体生长以及表达。而且许多表达的大肠杆菌在培养基中有葡萄糖的情况下,是不会诱导表达的
    据我猜测,你所说的别人做好的条件,也许是发酵罐上的条件,发酵罐上的可以控制溶氧和pH,一般在6小时左右(视菌体不同)10g/l葡萄糖可以消耗完,而根据我的实验10g/l葡萄糖摇瓶培养过夜,葡萄糖也消耗不完.在发酵罐上如果pH控制在6.0,乙酸效应很明显,菌体生长就很慢了
    你可以参照这个思路作以下
  • junhun (2014-4-21 16:20:03)


    个人观点:1.不加葡萄糖或降到很低浓度,避免葡糖效应。2、超声破碎要完全,否则蛋白会在沉淀中。3、 OD在0.4-0.6时诱导,低温,慢速。