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【求助】做WB遇见特奇怪的难题！
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我做WB快两年了，以前一直都很好，跑出来的条带都很亲清晰，不过最近的结果太差了，找了好久的原因也没找到，请有经验的不吝赐教：
我以前用的是25mM Tris,192mM glycine,20%甲醇，100V转膜80分钟，一直结果都不错，87KD的蛋白Marker很清晰
可是最近突然就不清晰了，而且是高分子量的和低分子量的同时不清晰（甚至没有条带）；
我换了电转槽，还是不行，后来我改成横流90mA分别跑了3个小时和5个小时，结果小分子量的还可以，87KD的和以前相比差很多，而且3个小时和5个小时的结果没有太大的差别，应该不是时间不够；
我又跑了140mA的条件，结果没有什么改变，还是不行；
后来我改用48mM Tris,39mM glycine,20%甲醇试了不同的电流和时间，87KD的效果还是和以前相差很多；
附：前段时间出现过一次这样的事情，因为原来用的是25mM Tris,192mM glycine,10%的甲醇，后来把甲醇的含量提高到20％后结果明显变好了，可是刚过一个月又不行了，还是高低分子量都不好。
问题是：到底是哪里出了错呢？做了好几年了，为什么现在就不行了呢，以前一直都很好啊。
请大家不吝赐教！多谢！
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最新回复
yjf1026 (2014-5-31 17:24:56)
先把药品重配，排除药品问题。
用的膜和以前的是一样的吗？不同批次不同品牌的膜还是有一些差距的。
膜在用之前的甲醇活化时间也是很重要的，可以试试把甲醇活化的时间延长一下。
wood533 (2014-5-31 17:25:15)
我后面做实验的时候用的缓冲液都是现用现配的(怕是缓冲液的问题);
用的膜都是一个公司的,而且是以前的是同一卷(PVDF);
膜的活化都是在无水甲醇里10秒,纯水中泡10分钟,然后在电转移缓冲中平衡20分钟以上,应该没有问题的,以前一直都是这样操作的啊.
还想问一个事情:12%的胶当溴酚兰刚好跑到胶的底部时候,和溴酚兰在差不多位置的蛋白能有多少KD?
多谢各位了!!
tuuu2 (2014-5-31 17:26:05)
和溴酚兰差不多的，大概是几个K，在它上面一点的是10K
wood533 (2014-5-31 17:26:27)
我的溴酚蓝跑出去后10KD还离最下面有0.5－－1CM，是不是丙烯酰胺和双丙烯酰胺的比例不对，从而使胶的浓度不对啊？
即使是胶的浓度不对的话对转膜的影响有那么大吗？电泳能在胶里分离的很清晰就应该可以转到膜上吧？
有具体做过这样试验的吗？说说看。
谢谢！
tuuu2 (2014-5-31 17:27:29)
都差不多是半厘米左右
胶不是你自己配的吗？我的是29.2：0.8，定容100ml
转膜的效果跟你的胶浓度没有多大的关系，主要的还是蛋白的参数
3648755 (2014-5-31 17:27:51)
关于膜的甲醇处理，国内好像都是写的甲醇活化30s，但是好多国外的资料都写的要活化20～30min的，我们做的时候也感觉甲醇活化时间足够的话转出来的结果不是很好（但不排除是实验室差异问题），所以如果可能的话我觉得你试一下多泡一会儿。
wood533 (2014-5-31 17:29:52)
wood533 (2014-5-31 17:30:14)
wood533 (2014-5-31 17:32:26)
今天和经理讨论了一下，他让我明天做一个在缓冲液里不放甲醇的（我做过的都是放10%----20%的甲醇），我估计效果应该很差，怕蛋白固定不到膜上，你们做过在缓冲液里不放甲醇的条件吗？如果做过给指点一下。
多谢两位！
831226 (2014-5-31 17:32:49)
呵呵，我一般把膜用甲醇泡20多分钟，效果很好：）建议一试。
wood533 (2014-5-31 17:33:44)
昨天跑的效果还不好，90KD的和65KD的差距特别大，而且缓冲液里不放甲醇的效果还不如放10％甲醇的，不过转膜完毕后我把胶都染了色，胶上的蛋白不是很多，和以前效果好的时候差不过，也就是说蛋白从胶里出来了不过没有转移到膜上，我怀疑是不是甲醇的问题（甲醇没有把蛋白固定到膜上），我今天又做了一批用不同公司甲醇的，等有结果再和大家交流。
甲醇的作用有这么大吗？有人做过甲醇对转膜的影响的吗？交流一下？
好惨啊！我们这里做生产，每天转膜24张，现在生产都受到影响了，大家有做过的快给点建议，多谢！
wood533 (2014-5-31 17:34:26)
今天刚出来结果，有所改善。我用了另一个公司的是甲醇，转膜完毕我染了胶，上面的蛋白很少，所以应该是固定的原因。
现在奇怪的是：Milipore的膜的说明书上建议的是用10％的甲醇，电转槽的说明书上建议用20％的甲醇，所以说应该是10％和20％都可以，没有太大的区别才对，可现在只是不同公司的甲醇差距就很大，难道甲醇在转膜过程中真有这么大的影响吗？如果真是那样的话不同的试验室怎么做试验呢？不可能要全球都用统一的甲醇啊！ 我现在有这样一个猜测：是不是转移槽或者其他一个设备的一个条件在慢慢恶化，但是不同浓度的甲醇可以部分的缓解这一恶化的条件，所以当把甲醇的浓度做相应调整后，转膜效果能维持一段时间，不过过一段时间后，恶化的条件又起主要作用了，转膜效果又不行了，如果真是那样的话那这个恶化的条件可能是什么呢？？
大家如果有想法就提出来，我做试验验证，到时候一起分享结果。
831226 (2014-5-31 17:34:56)
甲醇的作用应该就是活化膜的，是其容易和蛋白质结合，所以我想如果浸泡时间不够的话，膜没有很好的活化，和蛋白质结合能力也就差了，所以才会蛋白穿过膜而未结合。（跑到滤纸上去了应该是）
831226 (2014-5-31 17:35:20)
甲醇是起活化膜的作用，如果活化时间不够，则影响膜与蛋白的结合，很容易转过（到滤纸上），所以充分活化是必要的。
ladyhuahua (2014-5-31 17:35:58)
我也出现同样情况，用的是bio-rad的湿转，一开始做western很好，可是后来就不行了，结果是转印时纤维垫的问题，时间久了就薄了，转印夹夹得不是很紧，最近实验室刚来了一套国产的转印装置，做一下还不错，楼主能不能是这个原因？还有我试过不同的甲醇转印稍有差别。也请楼主推荐一下那个厂家的甲醇比较好使！
wood533 (2014-5-31 17:36:31)
不是纤维垫的问题，我开始也怀疑是纤维垫的问题，结果换了新买的bio-rad的配套垫子，结果没有改善；现在不同厂家的甲醇和不同的甲醇浓度之间差别蛮大的，我们现在也在找比较好的甲醇，以前用的是北京化工厂的，现在用的是益利的，还有北京化学试剂公司的，这几家公司的甲醇之间的价格差距比较大，以前一直用北京化工厂的，结果一直不错，如果你是做试验用量比较少的话你可以选那个，我们是做生产，用量比较大，所以要考虑部分成本，不过可能也会换回北京化工厂的。
wood533 (2014-5-31 17:36:50)
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我今天做了相关的试验，结果没有什么大的区别。
你说的情况很对（膜和蛋白结合的不好，蛋白被转到滤纸上去了，但应该不是活化的原因，我今天同时转了4张活化20分钟的，和其他20张活化15秒左右的没有太大的区别，而且我一直用活化15秒，也一直转的效果不错），现在我怀疑是不是膜的问题，因为在条带不明显的条带里从背面看却比转的好的条带要清晰，也就是说我的蛋白应该是转过去了，但是没有和膜结合住，而和膜结果密切相关的就是膜本身和甲醇，现在觉得甲醇的可能性有，但是膜本身的可能性比较大，请帮忙分析一下，谢谢！
3648755 (2014-5-31 17:37:56)
说了这么多,难道一抗和二抗都没有问题吗,我碰到到二抗用过一段时间失活的
yapuyapu (2014-5-31 17:38:17)
请问NC膜应该不要甲醇浸泡吧，我一般就放在缓冲液里湿润２，３分钟就拿出来转膜了。MARKER都转上去了，是不是自己的蛋白差不多就转上去了呢？谢谢指教。
831226 (2014-5-31 17:38:37)
一般说只要跟你的蛋白分子量差不多的marker能转上去，那么你的蛋白也就可以转上去的
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