【求助】全血基因组DNA提取问题

字体: 小中大 | 打印发表于: 2015-8-01 17:09 作者: bgf5 来源: 分析测试百科网

我用的是上海生工的血液基因组DNA小量抽提试剂盒（离心柱型）的，可是我提完之后跑电泳，看不到任何带子。我其中的问题可能是：
1）说明书---在500μl血液中加入800μl的TBP Buffer用1ml的Tip 头轻轻吹打使其彻底混匀，而后4,000转/分离心3分钟，弃上清。
本人做实验----离心转数8000转/分；弃上清时，我没有用枪头吸出，而是轻轻将上清液倒出，只留下管底一点点无色透明的沉淀，特别少。这样对吗？是不是上清去除的太多了？也不应该直接倒？我发现用枪头吸的话有时会吸到最底层的沉淀。
2）说明书---在准备好的200μl样品中加入500μl TBM Buffer，混匀；再加入4μl Proteinase K，混匀，55℃保温10~20分钟。
本人做实验---保温30-40分钟。因为我的血标本时间最长的可到14个月。是不是保温时间太长了？
3）我跑电泳的琼脂糖胶浓度为1%，我加的电压是250V,时间是20分钟。紫外灯下观察，什么也没有。
其他步骤完全是按照试剂盒说明书进行的。我已经连续做了6个，都不行！心里很难过。我们实验室的分光光度计不能用。现在放假，别的科室也没有人。我真是...
大家看看我到底是哪一步出问题了？还有，今天我怕是我采的血时间太长，DNA降解了，我直接抽自己的新鲜血提的DNA,还是不可以。实验室就我自己，我急的都哭了！明年就毕业了，可是连个DNA都提不出来，PCR更是别说！
更附：DNA提取试剂盒说明书，我实在找不出我失败的原因。

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【求助】全血基因组DNA提取问题

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veiwu (2015-8-01 17:09:34)

建议你不用生工的试剂盒，我们碰到过类似的问题，生工的人说是离心柱的问题。你可以买更好的试剂盒或用手提（加蛋白酶、RNA酶）
bgf5 (2015-8-01 17:37:40)

你好，我买生工的试剂盒还是别人介绍的。我原来买的赛百盛的，更是不行。你知道哪个公司的试剂盒比较好吗？还有，增加消化时间会不会好一些呢？是不是基因组DNA释放，不仅要破坏细胞膜又要破坏核膜，比较不容易呢？真是愁煞我了！
你说的用手提是什么意思，是用酚-氯仿的方法吗？我的邮箱是zhaomeixing@yahoo.com.cn。可以多介绍介绍吗？万分感谢！
别人都说DNA特别好提，而且我看了大家的提问，没有几个人问提DNA的问题，是不是我太笨了啊？哎...
nn255 (2015-8-01 17:38:06)

建议您用碘化钾的方法提取外周血DNA，这个方法简便、快速、经济，我实验了几次，结果比较理想。
nn255 (2015-8-01 17:38:35)

QUOTE:
原帖由 bgf5 于 2015-8-1 17:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
你好，我买生工的试剂盒还是别人介绍的。我原来买的赛百盛的，更是不行。你知道哪个公司的试剂盒比较好吗？还有，增加消化时间会不会好一些呢？是不是基因组DNA释放，不仅要破坏细胞膜又要破坏核膜，比较不容易呢？真是愁煞我了！
你说 ...
适当增加消化时间确实利远大于弊，我们经常消化半小时到两三个小时，因为前面的溶液里面有EDTA，所以基本不用担心DNA降解，放心消化。
另外，我也不推荐生工的试剂盒，但也相信他们的试剂盒会到这种程度，可能是样品本身或者操作有什么问题。
bgf5 (2015-8-01 17:39:08)

看到你真是高兴，刚才我在核酸技术版就得到你的答复了，我今天又提了两个，增加了消化时间（由原来的30分钟提到2个小时），我觉得效果好了很多。而且我新配制了电泳液和琼脂糖凝胶，带子跑的很好。
我想问你另一个问题：我提出DNA来，做PCR,然后酶切，我用的限制性内切酶是RsaⅠ和HindⅢ，这两种都是比较常见的酶，我买的是赛百盛的，可以吗？原来是想买生工的，可是看了大家说生工的酶不好，吓的我不敢买了。呵呵，我这回没有买错吧？
nn255 (2015-8-01 17:39:30)

一些大品牌进口的试剂盒说明书，通常把时间、产量等数据写的比较保守，而国产试剂盒喜欢写上他们做出来过的“最优”数据，来显示试剂盒性能多么的好。比如说半个小时就能提完****，反应5min就能****，实际上那些说半个小时就能提完DNA的，通常三步水浴时间加起来就是半个小时，除非别的操作不占用时间，那些反应5min的，经常是各种条件都是最合适的时候做出来的。
bgf5 (2015-8-01 17:39:53)

你说的可真对啊，我是自己做过才知道国产的是怎么样吹的，可真是害人啊！哎。。。白浪费我的眼泪了！
bgf5 (2015-8-01 17:44:18)

我最近又连续做了30多个，跑胶总是15个出8个，11个出6个，而且荧光特别弱，在普通紫外灯下根本看不到，在凝胶成像仪上也是特别弱。怎么会这样呢？难道非要我换试剂盒啊？苦！
www.1 (2015-8-01 17:44:37)

换个试剂盒吧
QIAGEN 的不错啊
DCS (2015-8-01 17:45:26)

价钱也不一样啊，QIAGEN的价钱估计是生工的10倍-20倍吧，摊便宜的结果，再说就不会学着变通一点，多加点PK，多消化一会，毕竟人的全血中DNA本来就不多
mickeylin (2015-8-01 17:46:07)

很多国产试剂盒都不错的,如上海申能博彩,天根公司的都不错,我们一直用,肯定没有问题,我今天还刚抽那
mickeylin (2015-8-01 17:46:30)

生工主要引物和测序不错,其他不一定了,每个公司都有自己的特色嘛,不能迷信!
bgf5 (2015-8-01 17:46:49)

你用的是天根的溶液型的，还是离心柱型的？我试着用别人的天根的溶液型的提的，DNA是提出来了，跑胶也比较亮，可就是杂带比较多。因为下一步我做完PCR后，还要酶切，怕杂带多了，影响我后续的试验。但是离心柱型的，我真是用怕了。不敢轻易去买了。。。我看了几个公司提DNA的试剂盒，都差不多，关键是哪个环节容易出问题呢？离心柱的成分？
bgf5 (2015-8-01 17:47:20)

我今天把我原来提的DNA（跑电泳也不出结果的）做了一下PCR，结果也是特别弱，而且我还不确定是不是真的目的DNA被扩增出来的，还是被污染了，本来今天想把结果给大家看的，可惜的是我没有带优盘，没有拷下来。明天上传给大家看吧！
bgf5 (2015-8-01 17:49:49)

价钱也不一样啊，QIAGEN的价钱估计是生工的10倍-20倍吧，摊便宜的结果，再说就不会学着变通一点，多加点PK，多消化一会，毕竟人的全血中DNA本来就不多

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呵呵，你说的可真是实在，要是便宜的话，我二话不说就买QIAGEN的了！我明天就按你说的多加点PK,不过消化时间我可不能再加了，我已经是37度消化过夜了。还有，如果真是因为全血中DNA很少的话，我再怎么消化也不出，怎么办？呵呵，不管怎样，做做再说！
baidukk (2015-8-01 17:50:05)

QIAGEN 的血液小抽50次的1300元
天根的也要三百多呢
其实如果QIAGEN的提的很好的话对后续的实验都是有好处的
会省很多的心
就是多了一千块钱
相信老板会出这个钱的
关键是自己省心啊。
ero11 (2015-8-01 17:51:02)

推荐天根的！国标
bgf5 (2015-8-01 17:51:39)

QUOTE:
原帖由 ero11 于 2015-8-1 17:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

推荐天根的！国标
你一定是用过天根的是吗？你用的是溶液型的还是离心柱型的？我试着用我同学的天根的溶液型的提的，量是多很多了，可是我感觉杂带很多。嗯。。。。我也说不好。。。呵呵，战友，你为什么这么挺天根啊？
bgf5 (2015-8-01 17:52:18)

帮我看看我的PCR,怎么这样啊？第一泳道为marker,最上是1000bp,我没有完全跑完。第二和第三泳道模板为DNA提的特别少的（电泳在凝胶成像仪上也看不到的）;第四泳道是DNA提的比较好的。我PCR扩出来的主带怎么旁边那么多杂带啊？是非特异条带，还是什么？

22460663.jpg
www.1 (2015-8-01 17:52:47)

基因组DNA 还是很好提的，根本不需要用什么试剂盒，1ml的全血足够了，提之前先用氯化铵溶血，然后分离出相对纯的白细胞，然后SDS/NaOH很容易就能提出来（具体步骤就不啰嗦了）。大了我不敢说，10kb还是有保证的。从你的电泳图可以看出，你的基因组DNA体的很差劲的，1000bp的都不多，另外你的电泳缓冲液可能也不行，连DNA ladder 都没有跑好，