查看完整版本请点击这里:
【求助】总RNA提取不出来
各位大虾!【求助】总RNA提取不出来
本人准备做椎间盘的髓核的水通道蛋白的相关研究,但是组织的总RNA老是提不出来!要不就是总的NG数达不到要求,要不就是OD值达不到!跑的胶是一片空白什么东西也没有!我用了TRIZOL也达不到要求!
请帮忙分析一下原因!!!!谢谢
查看完整版本请点击这里:
【求助】总RNA提取不出来
【求助】总RNA提取不出来
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2016-2-08 21:40 作者: 乌贼老弟 来源: 分析测试百科网
最新回复
baidukk (2016-2-08 21:42:37)
bring (2016-2-08 21:44:00)
我的两点建议:首先,除试剂盒有特别说明的步骤外,整个过程应该尽量保证在冰上进行。其次,组织研磨过程我以为很重要,一定要快,而且要尽量避免此过程中标本温度升高。所以,选择一种最合适的研磨工具和步骤是很必要的。
乌贼老弟 (2016-2-08 21:44:58)
操作应该没问题的啊!我请人家做过!还是没结果!用人家的TRIZOL还是没什么结果!真的很郁闷!!
乌贼老弟 (2016-2-08 21:45:37)
我以前用的是匀浆器,可是组织不能完全研磨碎!
乌贼老弟 (2016-2-08 21:47:14)
是不是用液氮研磨后还得用匀浆器匀浆?我用液氮研磨后已经是粉态的了!
viviwang1987 (2016-2-08 21:47:32)
我们的程序是加了trizol低温浸泡一段时间,然后用匀浆机在冰上匀浆。还有最后用洗RNA的时候一定要小心,很可能RNA丢失
cbou876 (2016-2-08 21:49:12)
用液氮研磨后就可以了,目的是使组织块变小,便于后一步加trizol使核蛋白体完全分解。加入trizol后,要确保trizol中的组织不能成团,有结团的话要吹打均匀。另外,加异丙醇反应这一步,要混匀使rna与异丙醇充分反应,使其沉淀。我之前有过深刻的教训,因为没混匀,白白浪费了一个多月,最后才找到是这个原因。还有可能就是rna出来后,加入75%乙醇这一步,要注意先加750ul乙醇,后加250ulDEPC水。
乌贼老弟 (2016-2-08 21:50:25)
谢谢各位!
我已经严格按说明书操作了,怎么还是提不出来啊!各位大侠有人用过PROMEGA的GV-total RNA isolution这个试剂盒吗?OD值为什么会出现负数啊?
等待各位的解答!!!
standbyme (2016-2-08 21:51:21)
我说几点建议:
1.液氮研磨时,要随时加入液氮,我们磨一个样本要加3-4次液氮,并且要快速研磨。最好能有个人帮助加液氮!
2.OD值出现负值……有可能是调零时没洗好吧!
3.怀疑一下,你的样品保存中没出现什么问题吧?比如说融化了什么的,那样RNA就降解了,虽然这种错误很少有人犯,但是,不排除可能性啊!
4.实验前的灭酶处理很重要,我们当时进行了好几天,剪刀镊子,研钵,饭盒,水,枪头,离心管……都用DEPC水泡了,然后高压,烘干,当时感觉可繁琐了,事实证明,前期工作做好了,后面会很省力的。
我也是第一次做,一步步很谨慎的走,希望你能成功!
standbyme (2016-2-08 21:51:47)
=========================================================
为何要先加750ul乙醇,后加250ulDEPC水?有什么讲究么?
yyaxw84 (2016-2-08 21:53:06)
我觉得你应该把你的详细步骤说出来让大家分析,既然你用别人的trizol和别人帮你做都没有做出来,我怀疑是不是你取材的时候没有注意,就是你在做实验之前,RNA已经降解了。如果是后面的实验步骤有些问题一般最后电泳都会看到降解的条带,不会什么都看不到。
standbyme (2016-2-08 21:54:07)
我觉得你应该把你的详细步骤说出来让大家分析,既然你用别人的trizol和别人帮你做都没有做出来,我怀疑是不是你取材的时候没有注意,就是你在做实验之前,RNA已经降解了。如果是后面的实验步骤有些问题一般最后电泳都会看到降解的条带,不会什么都看不到。
我这段时间提RNA 也是什么都没有,我的是霉菌,我想问一下,如果实验之前RNA已经降解了,电泳就什么都看不到吗?还是有降解带?谢谢
yyaxw84 (2016-2-08 21:54:31)
hold住 (2016-2-08 21:56:25)
yyaxw84 (2016-2-08 21:58:34)
QUOTE:
自己养的细胞应该还比较好提RNA,至少在你提之前它是活的。收集细胞的时候应该不会降解,因为你的细胞还在你的培养基里面,它还是有活性的。洗RNA的只要用DEPC水配就好了(但是乙醇最好是新开的),可以不用高压灭菌。xueyouzhang (2016-2-08 22:00:08)
你是怎么知道自己没提出来的?用rt-pcr来做pcr了吗?
最后离心后能看到试管底部的白色羽状固体吗
baidukk (2016-2-08 22:01:28)
把标本给我,我帮助你提取,不可能提不出来.
baidukk (2016-2-08 22:02:17)
乌贼老弟 (2016-2-08 22:03:48)
ROSE李 (2016-2-08 22:04:18)
有没有邮箱?我给你一个液氮研磨的好方法。
【求助】总RNA提取不出来