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突破性的蛋白A定量系统
工艺杂质的去除是生物制药产品生产过程中的关键一步，且监管指引要求鉴定出纯化过程中各个阶段的杂质。在商业化重组单克隆抗体生物药品的纯化过程中，含有固定化葡萄球菌蛋白A(天然蛋白A)、重组蛋白A(rPA)或蛋白A亚基(MabSelect SuRe™)的纯化树脂被广泛使用。必须对滤出的蛋白A进行灵敏分析，以确保此污染物不以不可接受的水平存在于终产品中。
目前定量蛋白A的方法(如ELISA)受到种种限制，如动态范围窄、灵敏度低和流程费时费力。通常需要对每个样品进行多次稀释或开展重复分析，才能获得落在标准曲线线性范围内的结果。
ProteinSEQ™ 蛋白A定量系统
Life Technologies的ProteinSEQ™ 蛋白A定量系统是一个突破性的免疫分析平台，它将基于TaqMan® Assay的qPCR分析的灵敏度和动态范围带到以抗体为基础的蛋白分析物检测中。系统借助邻位连接分析(proximity ligation assay，简称PLA)技术来定量某一目标蛋白。
为了实现最宽的动态范围、最高的灵敏度和重复性，他们开发出一种自动化、基于磁珠的固相 PLA平台，适用于MagMAX™ Express-96磁珠处理器。简单的流程仅包含三步(图1)。第一步，制备待测样品和标准品。样品制备包含简单的加热/冷却/离心过程，让与蛋白A分析物结合的IgG变性和分离。下一步，设置平板，而目标蛋白的捕获和探针连接都在MagMAX™ Express-96仪器上自动完成。简单来说，与链霉亲和素包被磁珠偶联的生物素化的蛋白A抗体可用于捕获蛋白A。洗涤之后，邻位探针(结合有寡核苷酸的蛋白A抗体)与蛋白A目标结合。一旦与目标蛋白结合，探针相互靠近，在与邻位探针杂交的夹板寡核苷酸(splint oligo)存在时由连接酶连接。最后一步，通过qPCR扩增连接产物，并根据标准曲线确定目标蛋白的量。
图1. ProteinSEQ™ 蛋白A定量系统的流程
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宽动态范围和灵敏度
流程的自动化以及固相磁珠的使用让系统实现了宽动态范围和高灵敏度。图2显示了典型标准曲线的数据，这是通过蛋白A标准品的5倍连续稀释产生的。曲线显示了 4个对数的动态范围，检测极限低至2.5 pg/mL。系统是高度重复的，正如不同3天产生的标准曲线所示。4个对数的动态范围已远远超过现有方法，减少了多次稀释待测样品或重复分析的需要，并确保在第一时间获得有效结果。
图2. ProteinSEQ™ 蛋白A定量系统的动态范围、灵敏度和重复性。
(A)利用ProteinSEQ™ 蛋白A定量试剂盒所产生的标准曲线来分析5倍连续稀释的MabSelect SuRe™ 蛋白A标准品，浓度从40 ng/mL到0.0025 ng/mL。
(B)利用ProteinSEQ™ 蛋白A定量试剂盒在不同3天分析同一个5倍连续稀释的MabSelect SuRe™ 蛋白A标准品所产生的三条单独的标准曲线。
定量回收和高精确度
ProteinSEQ™ 系统对各种待测样品实现了定量回收，这些样品一般是不同的生物工艺纯化样品。表1显示了加标在待测基质中的不同浓度重组蛋白A的回收，每个重复三次。所有加标浓度都获得了高于70%的回收率。三个重复样品的%CV证明了操作的高重复性。
表1. 加标在典型的抗体纯化工艺内样品基质中的Repligen® 蛋白A标准品的回收率和重复性，此基质包含0.8 M NaCl、20 mM NaPO4(pH 7.5)和10 mg/mL IgG，每个重复三次。
简单、高通量的流程在当天产生结果
自动化步骤和96孔板形式的结合实现了高通量的流程，适合工艺开发过程中所获得的典型样品的快速检测。系统在一天内可开展两次运行，产生最多48个待测样品的结果，每个重复三次。系统的通量、获得结果的时间及轻松的流程让它成为工艺分析检测实验室的理想选择，这些实验室负责迅速提供指导工艺鉴定决策和方向所必需的结果。
单个平台适合所有蛋白A目标
ProteinSEQ™ 系统经过设计，可检测和定量任何来源的蛋白A。图3显示了四个不同配体所获得的标准曲线。系统的重复性能表明，单个平台可支持使用不同蛋白A配体进行纯化的各种项目。
图3. 四种不同的蛋白A标准品所产生的标准曲线。Repligen® 重组蛋白A(蓝色)、天然蛋白A(绿色)、MabSelect SuRe™(红色)和Pierce® 蛋白A(黄色)。
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