【讨论帖】心肌细胞的密度,跳动频率,跳动幅度和...


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各位老师好:
我养心肌细胞也快两年了,开始自己在学校养的就是原代心肌细胞(Primary Cardiomyocytes, PCM),说句实话,开始养的时候,没人教的,自己以前也没养过细胞,看着丁香园和文献资料,自己总结瞎摸索,竟然也养出来了,细胞洁净度还可以,基本没污染过;现在嘛,在一家外企里,主要也是种植PCM,有仪器可以观察PCM的Beating rate 和Amplitude,现在稳定时的一般细胞Beating rate是90-100次/min,Amplitude是0.07(根据细胞跳动对电极阻值的变化计算得出),但在这有前辈稳定时做过Beating rate是120次/min左右,Amplitude是0.15(其人现已出国)。自己也希望能进一步改进,故在此有几个问题和大家商量一下:
1.96孔板细胞密度为多少时,细胞跳动的Beating rate和Amplitude会达到最好状态?(在实验水平稳定情况下,我自己的PCM密度是15K/well,而我们这前辈却是10K/well)
2.细胞计数时,什么样的细胞为心肌细胞,标准是什么,大小、形状?若是大小,若是以大小评价多大算是可以?
3.细胞密度是不是尽可能的越大就越好,这样细胞搏动一致性好,还是保持在一个合适的密度较好?
4.细胞老化问题,PCM消化不完全会起跳早,老化也早;消化稍过,会起跳晚,但成纤维细胞也长起来,造成干扰;我做过较早的有12h时就能跳,晚的有3-4d才跳。所以,细胞消化成什么状态才能算比较好,细胞跳动时间不早也不晚,持续跳动时间也很长?我们这有前辈24h开始跳,可持续跳动7d,细胞频率为90次/min以上,Amplitude是0.1以上。这其中关键的问题在于消化,怎样把握消化水平?


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  • vvmmoy (2015-5-11 16:28:20)


    楼主能否把你具体分离心肌细胞的过程帖出来,让我们这些初学者学习一下。我也是自己一个人按着丁香园上的帖子做的。培养的细胞洁净度很差,有很多死细胞帖子心肌细胞上,很难把它们洗下来。不知楼主如何处理这个问题?
    不好意思楼主的问题,我都还没有经验:
    第2个问题:细胞计数时我计得是那些大一点的,稍圆,看着饱满一些的。那种小小的应该不是心肌细胞,不知对不对
    第4个问题:我觉得用胰酶联合胶原酶不管细胞数量还是活力都较单用好,第二天换液之后,细胞跳动频率和力量都较好.
    把这个帖子顶起来,急需要这方面的经验
    这是我的图片:


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  • NBA (2015-5-11 16:30:19)

    下面的是我们这的前辈写出来的protocol,我们一直也用的是这个,仅供参考!
    Preparation:
    0.1% gelatin: 0.1g gelatin in 100ml PBS. After high pressure sterilization, gelatin dissolve and solution will be clear. Store at 4 ℃.
    Digest solution: 0.07% Trypsin with 0.05% Collagenase TypeⅡin HBSS.
    Coating methods: Add 50ul 0.1% gelatin to every well. Move the 96-well plate in 4°C. Overnight. Then get rid of gelatin solution. Move the plate to normal incubator.
    Methods:
    All experiments were performed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the US National Institutes of Health (NIH Publication No.85-23, revised 1996).
    Cardiac ventricular myocytes were prepared from 1- to 2-day-old Sprague-Dawley rats and rats would be kept in warm temperature.
    Cutting and isolation of hearts:
    Rats are sterilized by 75% alcohol. Cut chest wall and isolate heart by scissors. Hearts from neonatal rats should be rapidly excised, rinsed in ice cold DMEM, washed to remove blood and debris. Remove atriums from isolated hearts. Ventricles are left and moved in a bottle which with HBSS. Then ventricles are shredded into tissue fragments (1mm3). Get rid of HBSS. Add digest solution, move into normal incubator to begin digestion.
    Myocytes digestion:
    Tissue fragments are digested by stepwise trypsin and collagenaseⅡ. Each step needs 8 min, shake bottle every 4 min. Use glass pipette to blow the fragments. Aspirate supernatant and move into another tube with 10% FBS DMEM to stop digestion. Repeat the steps (4-5 step) until the fragments disappear. Centrifuge cell suspension with 800 rpm for 5min. And get rid of the suspension. Now the cells are in the bottom of tube. Add DMEM (10%FBS) and re-suspend the cells. Filter cells with filter (200 mesh).
    Myocytes enrichment:
    The dissociated cells are preplated to 25cm2 culture flask and back to incubator. Use 60 min differential adhesion to enrich the culture with myocytes. The nonadherent myocytes suspension is moved to a tube. The cells are counted and adjusted to a desirable concentration by adding DMEM with 10%FBS.
    Myocytes plating:
    Add 100ul cell suspension to each well. Cells are cultured in 96-well plates and are maintained at 37°C in a humidified incubator with 5% CO2.Change the medium at 48 hour. And put the plate in the station and record the impedance signaling. After 12h, cells would be used for experiments.
  • NBA (2015-5-11 16:30:56)

    QUOTE:

    原帖由 vvmmoy 于 2015-5-11 16:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    楼主能否把你具体分离心肌细胞的过程帖出来,让我们这些初学者学习一下。我也是自己一个人按着丁香园上的帖子做的。培养的细胞洁净度很差,有很多死细胞帖子心肌细胞上,很难把它们洗下来。不知楼主如何处理这个问题?
    不好 ...
    细胞洁净度的处理,我在DXY上看到过一位前辈曾说过,换液时可以可用PBS洗几遍,好像会少一些;我个人认为,死细胞是无法避免的,所以我们只能去尽可能的优化条件去减少死细胞的数量,而贴壁的死细胞可能与我们的培养条件有关,因为细胞是已经贴壁然后再死的(时间长了也会死的这个不算在内)。而整个心肌细胞培养的过程我觉得最关键的可能在于消化的控制,心脏剪碎和取心脏,因为这一方面决定了细胞的生长的状态和细胞活力,另一方面关乎细胞培养的结果可重复性,而在消化和取心脏过程中,我们应该尽可能的去注意条件和操作手法的控制(如消化时间,细胞冰浴,心脏取的大小等)。
    对于台盼蓝细胞计数,我一般也是数的是大的圆的,但有一些也是大的,形状不规则的,有时数量还比较多,不知各位老师也是否计算在内,我一般是计算的。从我使用的protocol来看,我用的也是混合酶消化,但同样的操作条件下,优秀结果的重复性太差,每次细胞的频率和幅度也不完全一致,可能因为仪器是通过检测,所以能够较精确的比较每一次的结果差异性,跳动的频率有时60多次,有时90多次;同时间细胞的跳动幅度也不一致;且细胞起跳时间也不一致,有时24小时就跳的非常好,而有时48小时才跳的勉强接受。
    不知各位老师对于心肌细胞原代培养有什么独特的好的想法,欢迎您提出来,我们大家共同讨论,三个臭皮匠顶一个诸葛亮嘛,祝每一次都能做出比较完美的结果,谢谢您!
  • 如影随形 (2015-5-11 16:31:15)


    楼主的照片很好看啊,我现在也在养心肌细胞。想请教楼主几个问题:
    1:楼主养的是什么的心肌细胞,我养的是SD乳大鼠(3天内)的原代心肌细胞和成纤维细胞,两种细胞我都要养,就 分离纯化很麻烦,现在也没有纯化的很好,想向你请教下。
    2:楼主是怎么纯化的啊?差速贴壁?多久的差速,还有您用的消化酶的类别和浓度,以及消化的时间。
    3:我的心肌细胞跳动的也有一周的时间了,但是就是这些活性好的心肌细胞在我养的cfs瓶中跳的很欢快,并且这片的整个视野都在同频率搏动,太郁闷了。
    4:楼主有没有在用5溴脱氧尿苷,你调的加入心肌细胞的瓶中的终浓度是多少的啊??
    十分期待楼主能够回帖。谢谢~
  • NBA (2015-5-11 16:31:37)

    QUOTE:

    原帖由 如影随形 于 2015-5-11 16:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    楼主的照片很好看啊,我现在也在养心肌细胞。想请教楼主几个问题:
    1:楼主养的是什么的心肌细胞,我养的是SD乳大鼠(3天内)的原代心肌细胞和成纤维细胞,两种细胞我都要养,就 分离纯化很麻烦,现在也没有纯化的很好,想向你请教下。
    ...
    谢谢这位战友,谢谢您的夸奖,图片虽好看但并不能解决我所遇到的问题。
    关于您的问题,我使用的Protocol中有的,您可以再看看;你所遇到的问题,就我知道的回答如下:
    1. SD乳鼠心肌细胞,分离纯化多用差速贴壁法分离,这样得到的纯度不是非常高,一般是够用的,看你实验而定;若需要高纯度心肌细胞的话,有条件可用hESCM细胞(胚胎细胞诱导分化的心肌细胞,国外多用),而高纯度成纤维细胞,不好意思,我也不是很了解;
    2.差速贴壁法60min即可,若希望心肌细胞纯度高,可以延长至90min. 消化酶:0.07% Trypsin with 0.05% Collagenase TypeⅡin HBSS,Each step needs 8 min, shake bottle every 4 min.
    3.心肌细胞的特点之一就是同步性,这是正确的,为什么会郁闷?
    4.我没有使用5-Brdu,若用的话,也可以的,前三天加入0.1 mmol/L,这园子里都有很多的,有时间你可以搜搜看看。
    谢谢您的参与!
  • iii_ii (2015-5-11 16:32:30)


    楼主,我也是养心肌细胞的,上年做了很久,都没有问题,后来就停了,今年又要做但怎么做也做不出来了,完全按以前的方法,细胞就是不活,老板催了很久再不活估计要怒了,真不知道问题出在哪里了,楼主分享下经验啊
  • NBA (2015-5-11 16:32:52)

    QUOTE:

    原帖由 iii_ii 于 2015-5-11 16:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    楼主,我也是养心肌细胞的,上年做了很久,都没有问题,后来就停了,今年又要做但怎么做也做不出来了,完全按以前的方法,细胞就是不活,老板催了很久再不活估计要怒了,真不知道问题出在哪里了,楼主分享下经验啊 ...
    你先把你的实验方法和步骤写出来,我们才能知道可能的问题在那些方面.
    我的经验和方法都在论坛里写出来了,还有可以参考一下论坛里的专题总结,有很多优秀的内容,我相信你的问题肯定有人遇到过,肯定可以解决好的
  • iii_ii (2015-5-11 16:33:06)


    谢谢楼主的回答,想再咨询几个问题。
    1、从您的Protocol中看,您是先离心再进行细胞筛过滤,这样做和先过滤再离心有什么差别?我们一般是先过滤再离心,并且是1000rpm、8min,是不是对心肌细胞会有较大的影响?
    2、还有对于消化过程中的过多的胶原,你是怎么处理的?我们用的也是复合消化,胶原酶Ⅱ的浓度都加到1g/L了,可是在消化过程中还是有很多的胶原,上清不是很好吸取,想请教楼主有什么更好的办法没有?有很多文献中讲到在心肌细胞中的胶原主要是Ⅰ型和Ⅲ型,那用Ⅱ型的胶原酶效果又体现在哪里呢?
    谢谢~~
  • NBA (2015-5-11 16:33:39)

    QUOTE:

    原帖由 iii_ii 于 2015-5-11 16:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    谢谢楼主的回答,想再咨询几个问题。
    1、从您的Protocol中看,您是先离心再进行细胞筛过滤,这样做和先过滤再离心有什么差别?我们一般是先过滤再离心,并且是1000rpm、8min,是不是对心肌细胞会有较大的影响?
    2、还有对于消化过 ...
    我知道的可能原因如下,如有不妥之处,请各位老师指点:
    1. 先过滤再离心和先离心再过滤我个人觉得在本质上是没有什么差别的,我们先离心再过滤的可能是我们习惯的问题吧,我觉得消化下来的细胞在消化液中停留的时间越短损伤就会越小.
    2. 我们使用的胶原酶浓度为0.05%,你说的“胶原”我猜测可能是细胞破碎释放的DNA,若条件可以,可加一些DNA酶,就没有难吸的粘稠物了。我没有用DNA酶,我的办法是消化静置以后,轻吸上清,不进行吹打,消化10多次后,再用含血清培养基进行吹打。另我好像记得sigma的Ⅱ型胶原酶更适合消化心肌组织,但具体原因没有深入了解过,抱歉!
  • xevin (2015-5-11 16:33:56)


    谢谢楼主,我昨天第一次养心肌细胞,但今天看状态很不好,贴壁松,不舒展,未见伪足,更加没有搏动,我把步骤大概写一下,希望楼主指点一二:
    一共用了6只乳鼠,整个过程中,除了洗心脏和剪心脏用PBS+glucose外,中和用的培养基是含钙镁的,配胰酶用的溶液是PBS+glucose,即不含钙镁的:
    1. 75%消毒小鼠,消毒后小鼠是活的;
    2.开胸,迅速取出心脏,置PBS+glucose溶液;同样的方法处理其余5只乳鼠;
    3.修剪6只乳鼠心脏,之后剪碎(剪不成1 mm的,大约1-3 mm不等吧;我是全部心脏取出来之后,统一修剪再统一剪碎,这样会不会不好?);
    4.胰酶(Gibico,买来就是配好的,0.25%,含EDTA,稀释成0.8%,用PBS+glucose稀释,胰酶事先已温育)消化,6只乳鼠同在一支50 ml离心管,放7 ml胰酶,37度水浴,10 min,边浴边轻摇(整个过程都在轻摇,基本没怎么间断,是不是不好?);
    5.取上清(没有静置)置于另一支50 ml离心管,该管置于冰中,预先放置预冷的20% FBS+M199(含钙镁);
    6.继续加入7 ml胰酶,37度水浴消化,消了6次,分别是10 min,10 min,6 min,10 min,6 min,6 min,取上清和中方法同上;最后三次消化可见胶冻状物质,我用枪头较用力吹打,可打散;
    7.3支离心管离心收集细胞(未过滤),以68 g,5 min离,见不到沉淀,换用200 g 5 min,沉淀还是不明显,将看到的沉淀吹散后以300 g 10 min离心,可看到少许沉淀;
    8.每支离心管以2 ml培养基重悬,种6孔板中的3个孔(1支管的东西种一个孔),镜下观察只有第3支管(即最后两次消化得到的上清)细胞才多,前两个支管收集的细胞加起来都没有第三支管一半多,而且有支管的细胞不透亮,稍有皱缩(今天看这个也的细胞基本死光);
    9.差速1 h。
  • NBA (2015-5-11 16:34:26)

    QUOTE:

    原帖由 xevin 于 2015-5-11 16:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    谢谢楼主,我昨天第一次养心肌细胞,但今天看状态很不好,贴壁松,不舒展,未见伪足,更加没有搏动,我把步骤大概写一下,希望楼主指点一二:
    一共用了6只乳鼠,整个过程中,除了洗心脏和剪心脏用PBS+glucose外,中和用的培养基是含钙镁的,配 ...
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    第一次养能注意到这么多细节并且做到这一步,已经很不容易了,没关系,不要担心,肯定很快能做好的!
    1-2 步:我觉得你的做法应该是可行的
    3:心脏取出后,可以稍微挤压几次,尽可能减少心脏内的残留血液,我觉得不要担心弄裂心脏,因为后来还要剪碎的,还有血小板等细胞可能在消化过程中会破碎和残留,无论哪种情况对后来的心肌细胞都不好的;心脏集中起来一起剪碎是可行的, 至少我一直都是这样做的,没发现有明显的问题的.
    4-6 : Trypsin浓度是可行的,只是我觉得单独使用可能会使细胞的损伤较大,需要的时间和酶量也较多,若有条件可以尝试使用两种酶(即trpsin+collagen 2),这样消化会快一些,损伤相对也小一些,不过trypsin单独使用也是可以的,消化液的量可以适当降低看看,摇晃动作不要太剧烈,摇晃轻柔一些,其实静置也行,中间时摇几下即可,我们是10只乳鼠约4-5mL,8 min/time,消化约10-12次。
    7:离心速度一般在800-1000 转/分钟,其实细胞在800时即可离心沉淀,低于800肯定是不行的,细胞沉淀不了;高于1000细胞会死亡率较高,一般中和后因为血清和消化液较多,整个细胞悬液浓稠度较高,可以用1000 转/分钟离心,转速较低时细胞可能难以沉淀,得率较低。
    8:细胞密度要在合适的范围,可以尝试一下不同浓度,因为每个人每一次得到的细胞活力和状态都有差异性的,除非技术非常稳定,次与次之间的差异性才会会减小,但每个人得到的细胞也会有差异的,而且一般来说差异会比较大;所以你可以接种几个密度,在细胞长开后能连成一片,一起跳动的,否则细胞较稀,一般只有自律细胞才会跳动,其它细胞基本不跳的,当然,如果不需要观察跳动,那就没必要了。
    9:差速贴壁1hr基本是够的,如果想要更纯一点的细胞,可以差速贴壁两次,45min/time,我一般第二次贴壁后还是能发现有相当一部分的成纤维细胞等细胞贴在瓶里(已经长出一些类似伪足的触角),这是从形态上观察的,而心肌细胞贴的也有一部分贴壁了,不过这肯定是要损失的,这样细胞的纯度也相对较高了。
    祝实验顺利!
  • NBA (2015-5-11 16:35:09)


    相关疾病:
    先天性卵巢发育不全综合征
    补充一下:
    首先声明这不是和大家炫耀,而是想说明现在的实验方法和技术可能是相对较稳定的,可以算是阶段性的结果给大家汇报一下,以下的结果是仪器检测的结果,现在我们的细胞Beating rate一般在35hr时就能非常稳定了,Beating rate一般为120- 140 time/min,跳动幅度在0.04-0.08,大约持续到45hr左右,Beating rate开始逐渐下降,持续到100 hr左右,Beating rate约为60-80次/min,而幅度增加到约0.1以上,基地材料为玻璃,Gelatin包被。
  • mickeylin (2015-5-11 16:35:30)

    真是高手!非常感激你的点拨!
    我想大家都不会认为炫耀,更多的是仰慕,betaing rate能有120,了不起!
    我今天重新做了一批,试了三种消化方式,0.05%胰酶+0.05%胶原酶,0.025胰酶+0.05%胶原酶,0.1%胶原酶,刚刚差速完毕,从目前来看,0.1%胶原酶得率高,从这一个小时贴壁情况来看,也是0.1%胶原酶贴壁得更好一些。使用了胰酶,在消化到第4-5次时就会出现胶冻状(或者称为鼻涕状更形象),一直消化到第7次,还是有,我到第8次消化前吹散,吹散了就基本看不见了,过滤时也不会堵孔(200目,70 um孔径),使用胰酶消化4-6 min,胶原酶消化有3次到了10 min,消化过程有轻晃,最后两次消化用巴氏管间断轻柔吹打,第一次消化液弃去。
    今天我把液体分成两管离心,收集细胞没有问题。看看明天的情况再来汇报,向您请教。
    再次感谢您细致的帮助,同时非常钦佩您在这方面的造诣。
  • mickeylin (2015-5-11 16:35:56)

    首先再次感谢!
    刚才看了昨晚养的细胞,胶原酶消化和0.025%+胶原酶的细胞均可见伸出伪足的不规则形状的贴壁较紧的细胞,虽然没有搏动,但这些应该是心肌细胞。
    这些不规则形状的细胞在差速前的孔(即差速后吸走,剩下的)较多见,而在差速后的孔(即差速后吸出来的部分种到的新孔)贴壁很少,即使贴上,也显然没有差速前的孔贴的紧,分析原因可能主要有两点:
    (1)差速后吸出来的部分可能本来就有很多是死细胞、细胞碎片,这些理所当然不会贴壁(而且会妨碍正常细胞贴壁),所以显得有很多细胞没贴上;
    (2)吸出来的部分细胞很多,种的太密,瓶皿底部没有足够的空间让细胞伸展。
    于是,我刚才把这两孔差速后的细胞稀释后种到别的板上(胶原酶消化的一分三;胰酶+胶原酶消化的一分二),不知道结果如何,但镜下看细胞状态似乎不太好,台盼蓝染,有较多死细胞。
    接种密度好解决,计数后种稀点就行了;但是这死细胞、细胞碎片、可能还夹着部分血小板,怎么去除呢?请问您差速后是单纯把液体吸出来直接种到另外的板上,还是再离心一次(如果低速离心,也许可以除去血小板,我们从全血血中分离单个核细胞就是用这种方法,去除血小板效果不错,但这心肌细胞,除了血小板,可能更多的是被破坏了的细胞碎片,其密度可能与细胞更接近,离心效果如何?)?
    再次感谢您的指点,祝工作顺利!
  • NBA (2015-5-11 16:36:14)

    QUOTE:

    原帖由 mickeylin 于 2015-5-11 16:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    首先再次感谢!
    刚才看了昨晚养的细胞,胶原酶消化和0.025%+胶原酶的细胞均可见伸出伪足的不规则形状的贴壁较紧的细胞,虽然没有搏动,但这些应该是心肌细胞。
    这些不规则形状的细胞在差速前的孔(即差速后吸走,剩下的)较多见,而 ...
    不用那么客气,我也是从丁香园的前辈和实验室的前辈们学习才逐渐了解的,其实也没什么的,从你的实验态度可以看出你以后也一定会做的很好的,我只不过比你早点接触而已,谈不上什么造诣,其实实验做的再好,也只是一项技术而已,有思考和有思想才是更重要的。
    从您的提供的信息来看,我了解的告知到如下:
    1. 血小板的去除:在前面的环节很重要,如果在取心脏和消化这两个环节能降下来,那么后面就不用很担心血小板的影响力,在心脏取出后可以立即多清洗几次(保持低温),在心脏剪碎后可以再清洗一次,消化得到的细胞悬液我一般是废弃的,因为这样得到的细胞一方面部分细胞会容易消化过度,细胞活力较低,另一方面细胞含有较多的血小板等,且细胞数量也较少,这我们做过比较的。我现在使用的是在消化10-12次后剩下的心脏组织,在10%FBS的培养基中吹打得到的细胞,这种方法得到的细胞活力高,且数量也多,质量较稳定。
    2. 消化条件的控制:在酶浓度控制的条件下(我们使用的浓度为0.07% trypsin+0.05% collagenase)消化时尽量控制力度和温度,动作轻柔一些可能会更好,室温不要太高,否则即使是吹打下来的细胞也会死亡率较高的。
    3. 差速贴壁:能贴下的部分为心肌细胞,部分为成纤维细胞等,但成纤维细胞会贴壁较快,所以在上悬液中残留的较少。差速贴壁后,取上清液进行计数,计数时一般只数大个的细胞,小的细胞就不计在内了,死亡率一般不要超过70%,否则细胞的状态一般大都不会好,正常在50%-60%之间,如果各方面条件都能控制很好,在30%以内也是很有可能的,再低的死亡率就不太容易得到了。
    以上的方法仅作为参考,建议你再想想哪些可能会适合你,这样再去做自己可能会更清晰一些,因为只有寻求到适合你自己的方法才是好的方法!
  • woshi (2015-5-11 16:36:40)


    首先非常感谢楼主这么详尽的介绍,我有点不太明白的是“我现在使用的是在消化10-12次后剩下的心脏组织,在10%FBS的培养基中吹打得到的细胞,这种方法得到的细胞活力高,且数量也多,质量较稳定。”你的意思是说10-12次消化的都弃掉,之后消化的上清保留下来,是吗,我想这是不是消化太多了呢,最多的细胞是不是在这10-12次中啊,之后的会不会不好?还有我差速贴壁后离心得到的沉淀怎么还是红色的,看来血细胞还是没有完全去除干净,你们离心后看到的沉淀是什么样的呢?还有一个问题,消化后的细胞用含血清的培养基中和后保存在哪,是四度或冰上还是室温就可以了,小说明下,我的做法是收集好了几管中和过的细胞一起离心,嘻嘻,不知道我有没有说明白?
    最后感谢楼主及各位同道提供的宝贵经验 !
  • bring (2015-5-11 16:37:08)

    QUOTE:

    原帖由 woshi 于 2015-5-11 16:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    首先非常感谢楼主这么详尽的介绍,我有点不太明白的是“我现在使用的是在消化10-12次后剩下的心脏组织,在10%FBS的培养基中吹打得到的细胞,这种方法得到的细胞活力高,且数量也多,质量较稳定。”你的意思是说10-12次消化的 ...
    头一个问题我也想问,意思是把前面10-12次消化所得的上清全部弃去,只留下最后的组织块吹打,然后收集细胞?
    离心后红色是沉淀是红细胞,我没遇到过,但有两点可供参考:
    1.没洗干净;
    2.尝试弃去前几次上清。
    4度和室温我也想问,我上次是放室温。
  • bring (2015-5-11 16:37:28)

    我刚才换液,有部分细胞在搏动了,如我前面一个贴子所述,差速前的那个孔细胞较多,铺开符合心肌细胞形状特点,细胞贴壁紧;差速后的贴壁不紧,但也有些在搏动。
    继续请教:
    1. 心肌细胞贴壁不紧,圆圆的在搏动的,这不会不正常吧?
    2. 和上面朋友的问题一样,您的意思是前面10-12次消化液全部弃去,留最后的组织块吹打,然后只收集这次的细胞?如果是这样的话,和组织剪碎的程度有较大关系吧,如果组织剪得较碎,消化到10-12次均弃上清,会不会损失的细胞有点多?
    3. 也和上面的朋友一样,中和后放4度?如果是放4度,中和液会先在冰上预冷吗?先预冷的话会不会因为温度变化大(消化液37度,中和液4度)而影响细胞活力?我昨天是中和后放室温,消化过程共持续约100 min,最后统一离心。
    我刚才把换下的培养基用台盼染,确实大部分是死细胞,如您所言,细胞死亡是很严重的。
  • NBA (2015-5-11 16:37:51)

    QUOTE:

    原帖由 woshi 于 2015-5-11 16:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    首先非常感谢楼主这么详尽的介绍,我有点不太明白的是“我现在使用的是在消化10-12次后剩下的心脏组织,在10%FBS的培养基中吹打得到的细胞,这种方法得到的细胞活力高,且数量也多,质量较稳定。”你的意思是说10-12次消化的 ...
    大家一起共同讨论,这样才会共同提高啊!
    1. “10-12次消化的都弃掉,之后消化的上清保留下来,是吗”,是的,我消化过程中得到的细胞,一方面细胞质量不均一,有的会消化过度,有的会状态很好,这容易导致每次实验的差异性较大,另一方面消化得到的细胞数量也较少,大约只有后期吹打下来到1/3左右,这当中还有部分细胞后来会死亡的,且大量细胞死亡时释放的各类物质也在一定程度上影响了其它活细胞的活力,从而可能导致整体细胞状态都不是很好。
    2. “还有我差速贴壁后离心得到的沉淀怎么还是红色的”,这种现象也是比较常见的,如果将消化得到的细胞一起离心就比较容易看到这种情况,若只用吹打后得到的细胞也有时会有种情况,我个人觉得血细胞基本是不可能去除干净的,只有可能减少,减少的方法我前面也提到过,若你有空可以看看。
    3. 消化后的中和液最好放低温放置,因为血清是可以中和酶的消化,但并不保证所有的酶都会被中和,所以需要低温来降低酶的活性,使中和后的细胞不被消化过度,另一方面细胞在低温下代谢也降低了,细胞也不易因为代谢过度而致使活力下降,处理方式主要有冰浴和4度放置等,这两种较为常见的处理方式都是可以的,我个人以前使用的一般都是冰浴,然后可以一起再离心。
  • NBA (2015-5-11 16:38:39)

    QUOTE:

    原帖由 bring 于 2015-5-11 16:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    我刚才换液,有部分细胞在搏动了,如我前面一个贴子所述,差速前的那个孔细胞较多,铺开符合心肌细胞形状特点,细胞贴壁紧;差速后的贴壁不紧,但也有些在搏动。
    继续请教:
    1. 心肌细胞贴壁不紧,圆圆的在搏动的,这不会不正常吧?
    2. 和 ...
    1. 心肌细胞贴壁不紧,圆圆的在搏动的,这是正常还是不正常,其实这并不好说,因为细胞之间的形态和状态也是差异较大的,且能搏动的心肌细胞也有多种,这其中也有差异的;不过我觉得若能搏动,至少说明有两点:一:这是心肌细胞的一种,二:这种细胞活力也较好,贴壁状态也较好,如果贴壁不好,那么估计是很难跳动的,我们可以观察到的跳动幅度,这个幅度相对于单个细胞(或细胞团)来说,运动量已经是非常大的了。
    2. 您的问题问到点上了,组织剪碎的程度是会影响消化的次数,一般比1mm稍大一点点也就可以了,这是肉眼估测的,并没有实际测量过,就算是1mm左右,也没关系,消化次数稍微减少一两次就可以了(或者酶减少一些也可以),但至少消化8次以上(组织量大约为原来的1/3左右),这样组织才会疏松,后面细胞才能在组织上吹打下来(可以换液吹打多次),否则细胞吹下来会比较少,最后还有可能会剩一些组织的,不过可以弃掉的。
    3. 温差的变化较大确实会对细胞有一定的不好影响,但比起消化一直产生的损伤,温差的影响可能也算小的了,所以只能舍车保帅了。