最新更新主题

【求助】奇怪的PCR结果

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2016-2-08 22:18    作者: superboy    来源: 分析测试百科网

查看完整版本请点击这里：
【求助】奇怪的PCR结果

今天，用一条引物对六种模板做了下PCR，结果如下：
如图，最左是marker，接下来6条是不同的模板（2-7道），8-11道分别是前面2.4.5.6道PCR的模板DNA，最右边也是marker。
使我疑惑的是：左边有三道点样孔很亮（3-5道），不知是什么原因造成的，好像是PCR结果没有跑下来。是DNA提的不纯，有残余吗？但是右边四道的模板DNA电泳结果却显示质量不错啊。我想既然模板DNA都可以跑下来，为什么PCR结果却滞留点样孔呢？
十分奇怪，在线等！
查看完整版本请点击这里：
【求助】奇怪的PCR结果


85865291.jpg


我也来说两句 查看全部回复

最新回复

  • newway (2016-2-08 22:19:26)

    你的模板是基因组DNA吧？加样空里应该是基因组DNA。你的PCR有问题，几乎就没有扩增！
    你的模板要比PCR产物大的多，所以没跑出来很正常！
    你就重新做PCR吧！没什么奇怪的！

  • yapuyapu (2016-2-08 22:19:42)


    感觉是基因组DNA
    1，3-5道，点样空有条带，模版量明显很大，抑制pcr扩增，建议稀释后再作
    2，8-11道，感觉你的dna质量也不是很好，不过应该稀释后可以扩得出来

  • superboy (2016-2-08 22:20:12)

    请问从图上怎么具体判断DNA的质量？我今天做了下OD检测，确实不太好，有蛋白残留。

  • bring (2016-2-08 22:20:59)


    一般来说，基因组DNA较大，所以如果用基因组DNA跑电泳的时候，只跑出一点点距离或聚集在加样孔，所以8-11有这样的现象，顾判断是基因组DNA，同时要注意3-5，8-11，在点样孔有条带，应该是蛋白整合模版DNA之后的现象

  • superboy (2016-2-08 22:21:42)

    我今天分别稀释了4倍和8倍，正在等待PCR结果。

  • yapuyapu (2016-2-08 22:22:02)

    又学到了点东西。
    我上次作pcr的时候
    跑有个目的基因的时候就出现亮带只存在加样孔，好像没跑出来一样，但同一cDNA的另外一目的基因和内参都跑的很好，因我是分别单独加样的，所以根据上面的分析是否考虑是该管模版量加多了。

  • superboy (2016-2-08 22:23:01)


    今天分别稀释了4和8倍，还是没能出来。我在想是不是体系有问题还是稀释倍数不够，真的搞不懂了。

  • yapuyapu (2016-2-08 22:23:18)


    还跑不出来，就去吧模版纯化一下，还有给个建议
    以后模版不要4倍，8倍稀释
    偶以前做的时候，稀释都是10倍，40倍，100倍稀释

  • october7 (2016-2-08 22:23:57)


    有蛋白残留一般并不影响PCR扩增，对酶切等纯度要求高的实验影响大。
    第8道DNA有降解，相应的第2道扩增正常；第11道DNA量很少，相应的第6道扩增正常；其它的DNA浓度太高，完整性太好，这样会影响变性的。
    建议：
    把其它DNA震荡5min，机械断裂DNA；
    稀释很多倍，1000倍以上，PCR灵敏度足够的；
    延长预变性时间到10~15min。
    结果好了分享一下。

  • superboy (2016-2-08 22:24:20)

    谢谢楼上的战友啊，我这几天正愁不知怎么做呢，分析的太对了。我今天问了老板，老板说我提DNA用的材料本身太小，不易破碎，让我仔细研磨，我正打算重新提DNA。不过听了老兄的建议，还是打算先按你的方法试一下。
    有一个疑问，你的建议是多选呢还是一套流程做下来？

  • 101010 (2016-2-08 22:25:14)


    不好意思，刚开做实验，想问一下提基因组ＤＮＡ的时候，不都要保证完整性吗，你们怎要故意机械破碎呀

  • superboy (2016-2-08 22:25:36)


    这个我也不是很明白，是不是跟变性有关？也可能是破碎细胞吧。

  • standbyme (2016-2-08 22:25:53)


    基因组ＤＮＡ的完整性对酶切，Southern等实验很重要，对PCR较小片段影响不大

  • panda王 (2016-2-08 22:26:55)

    不是破碎细胞，是破碎DNA！三个建议可用一种或多种组合。你老板的意见可能不对，你是DNA提得太好的没有P出来。当然，老板忙呢Smile

  • superboy (2016-2-08 22:27:15)


    DNA提的太好也P不出来？我以前还没听过，呵呵。先试试吧！

  • idea2011 (2016-2-08 22:27:45)


    可能是浅薄吧。我们实验室不管抽DAN基因组，还是质粒，都是有一步要轻柔，防止DAN断裂，这样会对你以后的PCR产生影响，我还是第一次看见，要故意打断DNA的。请教一下！

  • vcve (2016-2-08 22:28:05)

    DNA如果浓度低，完整性好对PCR影响不大。但如果浓度很高，象楼主的9/10道，完整性又很好，DNA就很粘稠。这样的DNA缠绕在一起，PCR变性就比较困难。所以稀释和打断DNA，或者延长预变性时间，对PCR是有帮助的。

  • dmg (2016-2-08 22:28:24)

    上样量和浓度还没说呢，怎么帮你分析啊？

  • chengjie79 (2016-2-08 22:28:52)


    Ha Ha! It's too simple, sometimes Naive!

  • superboy (2016-2-08 22:29:29)

    QUOTE:

    原帖由 chengjie79 于 2016-2-8 22:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    Ha Ha! It's too simple, sometimes Naive!
    我的上样量PCR结果是5微升，模板DNA是1微升。
    至于浓度，我这几种模板各自不同，但是有几个相近浓度的却结果大相径庭，有的能p出来，有的却留在点样孔中。
    其实我也怀疑浓度测量结果，这么微小的量测得不会太准的，只能做个参考。
查看全部回复 我也来说两句
查看完整回复请点击这里：
【求助】奇怪的PCR结果