查看完整版本请点击这里：
【分享帖】Chromatin Immunoprecipitation（ChIP）
【分享帖】Chromatin Immunoprecipitation（ChIP）
Chromatin Immunoprecipitation（ChIP）实验指南及技术总结
ChIP是一项比较流行的研究转录因子（ transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA片断——PCR分析。
在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。
我ChIP做的比较多，RIP和ChIP-chip也做过（ChIP-chip用的是罗氏Nimblegen的产品）。这边主要和大家交流一下做ChIP实验的心得。当然这个帖子肯定会有很多漏洞，但是希望能一起讨论一下。另外如果有同学对RIP或者ChIP-chip有兴趣，可以在回帖中指出来，我尽量及时回答。
PS：我的实验步骤基本参考upstate试剂盒的说明书。
[ 本帖最后由 superboy 于 2013-4-13 10:45 编辑 ]
查看完整版本请点击这里：
【分享帖】Chromatin Immunoprecipitation（ChIP）
【分享帖】Chromatin Immunoprecipitation（ChIP）
最新回复
superboy (2013-4-13 10:45:25)
一、ChIP实验步骤
第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml）
2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。
450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。
6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。
将2管混在一起，共800ul。
7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。
（二）、除杂及抗体哺育。
8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。
留取300ul做实验，其余保存于－80度。
300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。
10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。
11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。
（三）、检验超声破碎的效果。
取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。
第二天：
（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。
12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。
4度颠转2h。
13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。
洗涤溶液：a. low salt wash buffer----one wash
b. high salt wash buffer-----one wash
c. LiCl wash buffer------one wash
d. TE buffer------two wash
15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul 10％SDS， 100ul 1M NaHCO3， 800ul ddH2O，共1ml。
每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。
16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。
混匀，65度解交联过夜。
第三天：
（一）、DNA样品的回收
17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。
18、每管加入10ul 0.5M EDTA， 20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。
45度处理2h。
19、DNA片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。
（二）、PCR分析
superboy (2013-4-13 10:49:47)
二、技术总结
（一）、关于细胞
细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。
一般细胞长到75％－80％比较好。
（二）、关于抗体！
抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。
单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。
一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。
（三）、关于交联与超声破碎！
这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。
交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。
一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。
一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。但是200bp－2000bp的范围也是可以接受的。
（四）、关于操作
希望尽可能的保持低温（4度）。
沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其完全沉降。
虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。
（五）、关于解交联
虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。
（六）、关于DNA片段的回收
需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。
小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。
另外还有一些，一时想不起来。以后慢慢补充吧。
H2O (2013-4-13 10:50:19)
当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
如果是表达的蛋白彼此很靠近，是否会交联成为一个大的团块么？
期待战友们的讨论
Ao7 (2013-4-13 10:50:39)
如果是表达的蛋白彼此很靠近，是否会交联成为一个大的团块么？
你说的对。但是什么是“很靠近”呢？酶和底物；组蛋白和基因组；转录因子和启动子，那种才是靠的很近的关系。
xueyouzhang (2013-4-13 10:51:00)
对于chip on chip 芯片数据有没有研究呢？
mickeylin (2013-4-13 10:51:40)
非常感谢楼主分享自己的宝贵经验！
有个问题想问一下，我最近也打算做CHIP，看到很多文献都是用的Upstate的试剂盒，请问楼主也是用的该公司的Kit吗？谢谢！
lxh031 (2013-4-13 10:52:10)
请问：可否用Chip法检测NF-kB与DNA的结合能力吗？与EMSA相比有什么优势吗？
superboy (2013-4-13 10:52:58)
===============================================================
罗氏直接把分析好的数据寄给我了，我还没有能力进行芯片的数据分析，呵呵。
superboy (2013-4-13 10:53:27)
======================================================================================================
我也是用了Upstate的Kit。因为一开始，只有Upstate有ChIP的试剂盒，但是现在有很多厂家开发了ChIP的试剂盒，选择面也很广了。
superboy (2013-4-13 10:54:01)
===============================================================================================================
与EMSA相比，优势就是直接研究了体内的情况。EMSA，并不能真实地模拟体内的环境，蛋白分子和核酸分子的浓度也发生变化了，更不用说蛋白分子和核酸分子在细胞内的定位问题。
“所谓的EMSA，其实就是在体外，将某一种核酸和某一种蛋白混合在一起，然后看它们是否能相互结合。
但是众所周知，体外环境和体内环境是完全不同的。
很有可能在体内，这种核酸和这种蛋白由于细胞区域定位的问题，根本不会相遇，也根本不会有结合的事情发生。但是在体外，当它们相遇时，它们却能结合。
也有可能在体内，这种核酸和蛋白的浓度相当的低，在这样低浓度的状况下，它们不会结合。但是在体外EMSA实验中，核酸和蛋白的浓度都增加了好几十倍。导致反应向阳性的方向进行，这种情况又该如何解释？
所以EMSA结果阳性，是能结合的必要条件，但却不是充分条件。”
ChIP结合realtime－PCR，基本上还是能相对真实的反映细胞内部转录因子和启动子的结合。但是具体问题具体分析。
abc816 (2013-4-13 10:54:26)
请问楼主做RIP用的什么试剂盒？
superboy (2013-4-13 10:55:16)
QUOTE:
RIP没有用试剂盒，是根据下面链接里的方法做的。自己配了试剂。这个protocol不错，效果蛮好的，推荐一下：）
cuturl('http://www.epigenome-noe.net/researchtools/protocol.php?protid=28')
qqq111 (2013-4-13 10:55:46)
RIP有专门的试剂盒，8月份新出的，12T据说要五千多，还要配套磁力设备要1千多
17-700 Magna RIP—12 IP reactions, includes negative
control IgGs, no positive control
•17-701 EZ-Magna RIP—12 IP reactions, includes 2
reactions of positive control AbAnti-SNRNP70
•17-704 Magna RIP (Quad)—48 IP reactions
有用upstate ChIP试剂盒基础上改装来做RIP的同志吗？
qqq111 (2013-4-13 11:02:54)
any333 (2013-4-13 11:03:40)
借这个帖子忽然想到个问题，目前研究蛋白和蛋白互作有经典的酵母双杂交以及后续的BiFC等；研究蛋白和DNA或是RNA互作有ChIP,如果是研究DNA与DNA或RNA之间的互作有什么方法吗？或者在信号途径的传导中，目前有研究是做DNA与DNA或RNA互作而调控的吗？有高人能回答下吗。
abc816 (2013-4-13 11:04:11)
CHIP的试剂盒用millipore-upstate,货号17-371最为常用,效果老好了,有需要随时联系!
不是卖试剂哦!
紫烟 (2013-4-13 11:04:36)
好贴，收藏了先。我也打算做ChIP,目前对一些细节还不是很清楚，能否请教一下，启动子区的引物如何设计，如何保证其特异性?谢谢！
duoduo (2013-4-13 11:14:58)
请教达人：“在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。”
这个怎么加？
lxh031 (2013-4-13 12:32:43)
请楼主最好举例说明。多谢！！
superboy (2013-4-13 12:33:40)
异丙醇加个四分之一嘛
input是用来衡量不同种类的细胞的细胞量的。比如两种细胞A和B，研究某转录因子在这两种细胞中与某一个启动子的结合情况。那么细胞A和B的起始量必须是一样的，这个起始量就用input来控制。相信你已经看了protocol了，在操作过程的某一阶段中，取出等量的样品做为input，衡量input中该启动子的量，算出一定的比例（就是细胞量的比例）。最后ChIP得到的得到的数据要除以这个input的比例，方才是相同细胞量下结合情况的差异。
【分享帖】Chromatin Immunoprecipitation（ChIP）