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头痛
看到版上经常还是有许多战友为引物的设计感到头疼。不过这也难怪，虽然原理我们都知道，但是设计的时候却未必能都考虑的很完全。
在这里我向大家隆重推荐一个在线的引物设计软件，是斯坦福大学的，我认为是最好的在线引物设计软件，我用它设计接近100多对引物，可以说是屡试不爽。它用起来也很简单，最重要的是效果非常好，考虑的因素也非常的多。
先不说那么多了：网址：cuturl('http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer')
下面我继续图示。
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最新回复
mamamiya (2015-5-04 17:46:04)
首先输入你想要p的片断，含有数字也无所谓，选择pcr选项。
59070193.snap.jpg
mamamiya (2015-5-04 17:47:55)
其中在Select YES to Amplify a region with EXACT endpoints of the DNA sequence entered NO YES这一项中，一定要选择yes，其他的各项目，大家可以点击查看说明，也都是非常的好理解。暂时，我们先不要改软件自设的默认值，直接submit
57632095.snap.jpg
mamamiya (2015-5-04 17:48:52)
然后我们就得到了结果，它会把所有可能的引物都会列出来，而且会把最好的一对帮你挑选出来，of course，我们要选择最好的。
mamamiya (2015-5-04 17:49:09)
然后点击“This is the BEST pair of primers”就得到了设计好的引物。而且也会显示出“The sequence of DNA that will be amplified by these primers is ”如果你不放心，你可以将该序列和你的原始序列比较一下，不会有问题的了。
75268625.png
mamamiya (2015-5-04 17:49:55)
当然这是最顺利的情况，但是有时并不是这么简单，例如我前两天帮一个战友设计引物，他想要的序列：
atcgat cagattatca aataatatac caaaattgat acatatgata catatgaatg
721 atatatgttt tggatatatt atttgttaaa attaattcat caggtgatga tgtgatgata
781 atcattgaaa aatgacaaaa atcccctgat taagtataat aaaaatagta agtaaaaaag
841 gcaaattttt acttacaaaa tattacatat tggaataaat aatttaatct ttcatatata
901 taactgtgat acatcataaa tatatatata gcaaaagaaa gatataaatt attatcattt
961 tttttgatca ttattgctat aattattatc ctgcttgttt aactataata atagcaatga
1021 atgaatcaaa atttaaatga tacgttaaaa tccaaccaat atgttataaa ttttctttca
1081 ttt
mamamiya (2015-5-04 17:50:37)
我们直接提交得出的结果：
92418013.snap.jpg
mamamiya (2015-5-04 17:51:40)
这样的话，按照默认的设的值并不能得到合适的引物，很明显如果让我们自己人工设，可能就不会考虑这么的详细：首先第一个问题，GC含量太低。
95493832.snap.jpg
mamamiya (2015-5-04 17:52:20)
为了重新设计，我们点击浏览器上的后退，回到前一页，也就是默认值的设定这一页。
14090556.snap.jpg
vcve (2015-5-04 17:52:51)
谢谢楼主，可是我的基因出来的是这种结果怎么办？
Primers for PCR
There were 1 forward primers in the valid range for GC content.
There were 4 reverse primers in the valid range for GC content.
There were 1 forward primers in the valid range for melting temperature.
There were 0 reverse primers in the valid range for melting temperature.
ERROR
The Tm range was too stringent, no primers were found in that range
mamamiya (2015-5-04 17:53:20)
我们可以改两个地方，第一，Optimum primer length: Minimum length: Maximum length:中，我们可以将Maximum length改成一个更大的值，例如35；Minimum GC改成20，然后submit，
可是我们发现还是有问题。
66113537.snap.jpg
mamamiya (2015-5-04 17:54:08)
71804732.snap.jpg
mamamiya (2015-5-04 17:54:24)
相关疾病：
电击伤
就这样，有时默认值不行的，可以微调一样，便很容易得到比较理想的引物。我用了那么久，几乎从来没有问题。大家可以随时点击【info】选项，进一步深入了解每个选项的意思。
vvmmoy (2015-5-04 17:56:32)
参数改了好多还是不行，要不你再帮我看看，谢谢了，呵呵
1 ggatccccgg gcagagctgg ggggggattt gttagcatct cttgataaac ttaattgtct
61 ctcgtcactg acggcacaga gctattgatg ggtctcaacc cccagctagt tgtcatcctg
121 ctcttctttc tcgaatgtac caggagccat atccacggat gcgacaaaaa tcacttgaga
181 gagatcatcg gcattttgaa cgaggtcaca ggagaaggga cgccatgcac ggagatggat
241 gtgccaaacg tcctcacagc aacgaagaac accacagaga gtgagctcgt ctgtagggct
301 tccaaggtgc ttcgcatatt ttatttaaaa catgggaaaa ctccatgctt gaagaagaac
361 tctagtgttc tcatggagct gcagagactc tttcgggctt ttcgatgcct ggattcatcg
421 ataagctgca ccatgaatga gtccaagtcc acatcactga aagacttcct ggaaagccta
481 aagagcatca tgcaaatgga ttactcgtag tactgagcca ccatgcttta acttatgaat
541 ttttaatggt tttattttaa tatttatata tttataattc ataaaataaa atatttgtat
601 aatgt
mamamiya (2015-5-04 17:58:34)
很多时候虽然它给出的结果看上去并不是那么好，但是用起来还是没有问题的。你试试我给你设计的这个吧。
vvmmoy (2015-5-04 17:58:53)
N端和C端的差别怎么看，参数怎样修改才好，不会每个都试一下吧，你怎么修改的参数，另外我设计出来的怎么都是上千的大片段，怎么改成几百的，我还有一个基因，可能也是极品，自己设计了两对，摸了n多的条件，到现在也没扩出来，多谢了，再帮帮忙，好人做到底了。呵呵
gATAGCTGCC ATCGGCTGAC CTAGAGAAGA CACATCAGCT GATCCTTTGG 50
ACCCTCTGAC TTGAGACAGA AGTTCTGGGC TTCTCCTCCT GCGGCCTAGC 100
TCTGAGACAA TGAACGCTAC ACACTGCATC TTGGCTTTGC AGCTCTTCCT 150
CATGGCTGTT TCTGGCTGTT ACTGCCACGG CACAGTCATT GAAAGCCTAG 200
AAAGTCTGAA TAACTATTTT AACTCAAGTG GCATAGATGT GGAAGAAAAG 250
AGTCTCTTCT TGGATATCTG GAGGAACTGG CAAAAGGATG GTGACATGAA 300
AATCCTGCAG AGCCAGATTA TCTCTTTCTA CCTCAGACTC TTTGAAGTCT 350
TGAAAGACAA TCAGGCCATC AGCAACAACA TAAGCGTCAT TGAATCACAC 400
CTGATTACTA CCTTCTTCAG CAACAGCAAG GCGAAAAAGG ATGCATTCAT 450
GAGTATTGCC AAGTTTGAGG TCAACAACCC ACAGGTCCAG CGCCAAGCAT 500
TCAATGAGCT CATCCGAGTG GTCCACCAGC TGTTGCCGGA ATCCAGCCTC 550
AGGAAGCGGA AAAGGAGTCG CTGCTGATTC GGGGTGGGGA AGAGATTGTC 600
CCAATAAGAA TAATTCTGCC AGCACTATTT GAATTTTTAA ATCTAAACCT 650
ATTTATTAAT ATTTAAAACT ATTTATATGG AGAATCTATT TTAGATGCAT 700
CAACCAAAGA AGTATTTATA GTAACAACTT ATATGTGATA AGAGTGAATT 750
CCTATTAATA TATGTGTTAT TTATAATTTC TGTCTCCTCA ACTATTTCTC 800
TTTGACCAAT TAATTATTCT TTCTGACTAA TTAGCCAAGA CTGTGATTGC 850
GGGGTTGTAT CTGGGGGTGG GGGACAGCCA AGCGGCTGAC TGAACTCAGA 900
TTGTAGCTTG TACCTTTACT TCACTGACCA ATAAGAAACA TTCAGAGCTG 950
CAGTGACCCC GGGAGGTGCT GCTGATGGGA GGAGATGTCT ACACTCCGGG 1000
CCAGCGCTTT AACAGCAGGC CAGACAGCAC TCGAATGaGT CAGGTAGTAA 1050
CAGGCTGTCC CTGAAAGAAA GCAGTGTCTC AAGAGACTTG ACACCTGGTG 1100
CTTCCCTATA CAGCTGAAAA CTGTGACTAC ACCCGAATGA CAAATAACTC 1150
GCTCATTTAT AGTTTATCAC TGTCTAATTG CATATGAATA AAGTATACCT 1200
TTGCAACC
vvmmoy (2015-5-04 17:59:15)
mamamiya (2015-5-04 18:00:15)
根据结果里面，哪一项不符合，然后适当的把条件放宽。
2都是上千的大片段，怎么改成几百的？
我看不懂Question引物长度是有限制的啊
3还有一个基因，可能也是极品
授人以鱼，不如授人以渔，对不对？vv
mamamiya (2015-5-04 18:00:59)
46XX性发育睾丸疾病
这个非常好设计啊，把tm稍微降低就可以了啊，而且肯定也不会影响效率的啊
89834643.snap.jpg
vvmmoy (2015-5-04 18:01:42)
呵呵，谢谢楼主，我也是看那项不符合再修改那项，不知道这样放宽条件设计的引物好用吗，你有没有试过这样的能P出来吗？
这个扩出来的是1208bp，太长了吧，引物长度是可以改，但是跟PCR产物的长度没有关系吧，我是想问怎么设计几百的PCR产物长度。多谢了，这个设计软件的网站很好用。
mamamiya (2015-5-04 18:02:04)
我试过，是没有问题的。
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