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【求助】MSP电泳图结果 求解
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各位大虾好~小女子本就外行，现初涉MSP，今有图一张,具体信息如下：
截取的复合图内，是同一批样本做的两个基因，上图是上周五做的，下图是今天的。
1，首先想要求证的是下图中小于100bp的诸多浅条带都是引物二聚体是吧？（之前听人说过小于100bp的都是引物二聚体）
2，下图中的Ben和SK-C两个样本为什么既没甲基化条带又没非甲基化条带呢？
不是应该至少有一条的吗？我想应该不是修饰失败的缘故，因为在上图另一个基因中这两个样 本也是有一个条带的啊。难道是因为下图就晚做两天，修饰的DNA降解得厉害以致没有任何条带？。。很困惑，望前辈们指点一二^_^
感谢~~~
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最新回复
2541 (2015-8-01 15:49:56)
我来试试，期待高手砸砖：
根据你的图片，M和U的扩增片段大小应该都在150~160左右（楼主做的是p16？呵呵呵）
1：应该是引物二聚体。特别是在下图中空白对照中（只有引物没有模板）这些浅条带的出现更支持引物二聚体的判断。
2：我也同意你的判断,可能是模板降解了。因为你前一批的MSP没有问题，就可以排除模板修饰不全和PCR扩增本身失败的可能性。
我不知道你的基因组DNA来自于什么标本？组织（新鲜还是石蜡包埋）？外周血？细胞株？我以前做石蜡包埋组织基因组DNA的甲基化，取2ug用zymo的修饰试剂盒修饰后10ul洗脱，各5ul分装于200ulPCR管负70度冻存（不超过一周），MSP时先配好PCR的反应液，再直接取出模板解冻加样上机扩增。
前一段时间从细胞株中提取基因组DNA，同样以2ug用zymo的修饰试剂盒修饰后可以用至少20ul洗脱，然后以5ul分装负70度冻存，取2.5ul行MSP或者BSP，模板切忌不要反复冻融（超过3次就很难扩增了），按照这样的保存条件，修饰后的模板在2个月后拿出来依然能P出很漂亮的条带。
MSP确实比常规PCR难一些，所以对酶的要求比较高，建议使用takara的hotstart，我以前就用这个做MSP，现在也用过ABI的amplitaqgold，效果也不错。
PS:你的电泳图上下颠倒了，看着怪怪的。
一点拙见，供参考。
wanglaoshi (2015-8-01 15:50:16)
恩，修饰产物是要分装保存的。呃，不过我有疑问了 您最后PCR前取的修饰后DNA不用定量的吗？因为我觉得各个样本经修饰后回收的量不是存在差异的吗？
=_=我怎么觉得倒着看顺呢~嘿嘿 下次我会注意的^_^
呵呵 偶做的不是p16
wanglaoshi (2015-8-01 15:52:55)
QUOTE:
恩，我用的就是takara的hotstart酶~谢谢你~veiwu (2015-8-01 15:54:53)
wanglaoshi (2015-8-01 15:59:43)
QUOTE:
恩，也是~只是新手对自己的操作手法还不足自信 嘿嘿那譬如说 我上图中的非甲基化条带亮度各有差异（PCR时我定量了修饰后DNA的量，都取20ng） ，说明的是不是 这个基因模板的非甲基化表达量的差异呢？本人不是学分子生物的，所以会问些估计让内行人哭笑不得的问题，请见谅^_^
am10 (2015-8-01 16:00:22)
MSP的结果解释：对于一个样本，特定基因的某一区域（一般都是启动子），MSP如果只扩增出U条带，说明该基因的这一区域在该样本中是非甲基化的，反之，如果MSP只扩增出M条带，说明该基因的这一区域在该样本中非甲基化的。如果既有U条带，也有M条带，则说明该基因的这一区域在该样本中是不全甲基化的。
MSP只是看有和无的，只是定性，不是定量，有就有，没有就没有，条带亮度差异不能说明甲基化程度的差异。如果你要进一步比较甲基化程度的差异，可以做BSP，通过测序来比较每一个CpG位点的甲基化百分率。
wanglaoshi (2015-8-01 16:01:06)
MSP只是看有和无的，只是定性，不是定量，有就有，没有就没有，条带亮度差异不能说明甲基化程度的差异。如果你要进一步比较甲基化程度的差异，可以做BSP，通过测序来比较每一个CpG位点的甲基化百分率。
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之前也网上搜过一些这方面的资料，但就是没有得出系统性的结论。今见前辈做这总结性言论，甚是喜悦和满足~有种拨云见日的欣然~~十分感谢！~
日后有相关问题 都要烦您指点啦~嘿嘿O(∩_∩)O
wanglaoshi (2015-8-01 16:01:27)
今天的结果也是让我很费解，很是无奈且无助。望路过滴前辈们给指点下哈^_^
1.“空”的U 跟 M在目的条带位置怎么都隐约出现了暗带呢？难道说明有模板污染？
2. 由于问题1的存在，所以在S C 1 2 3这五个样本的M 出现的条带可信吗？这个条带能作为其有 甲基化条带的判断吗？
3.忽视以上我的疑问，望高手们分析分析你们如果拿到这个结果，作何结论？
嘿嘿 看到zitong1983在线呢 希望你能看到此贴并出手相助哈O(∩_∩)O
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dior (2015-8-01 16:01:45)
空白对照都出了目的条带，看来肯定是有污染了，一定要排除模板污染后，得到的结果才可信。
单就这五个样本而言，每例样本均同时扩增出M和U两条带，说明每例样本中你研究的基因在特定区域均是partially methylated.所以仅凭MSP的结果无法比较这几个样本间特定基因特定区域的甲基化程度差异。
wanglaoshi (2015-8-01 16:02:08)
怎么就被污染了呢，看来是要重来一次了。。。
whitesheep (2015-8-01 16:02:24)
bring (2015-8-01 16:02:47)
QUOTE:
可能是你的样本中存在一定量的正常细胞或组织，所以U带恒定出现。当然，癌组织中的抑癌基因启动子区也不是百分百甲基化的，亦可能有某些肿瘤细胞为非甲基化。toy (2015-8-01 16:03:08)
非常感谢楼上的解答。我本来对这样的条带也是半信半疑，因为我觉得无论是任何标本为什么这些条带都这么一致，而且我跟楼主情况一样，空白组也居然跑出类似的条带，后来换了下热启动酶缓冲液MIX，空白组就跑不出这样的条带了。自我感觉也没有污染。参考文献提供的退火温度是62度，而我目前所做的退火温度为54度（引物根据参考文献设计），我们做的是人体不同部位的标本。请问楼上专家，相差这么大的温度，正常么。谢谢！
ending (2015-8-01 16:03:32)
QUOTE:
可以试试再把退火温度提高一点。为避免MSP的假阳性，PCR的退火温度不能太低，循环次数不能太多。
MSP确实是检测甲基化的一个快速灵敏的手段，但是由于它存在无法避免的假阳性可能，所以近年来逐渐被审稿人诟病，要想自己的文章档次高一点，经费也允许，还是做BSP吧，或者选用其他高通量的方法。
hyuu (2015-8-01 16:03:51)
ns5fan (2015-8-01 16:04:09)
甲基化中糖原的作用大吗？如果不加糖原的话，－20摄氏度沉淀过夜会产生沉淀吗？每次做到这一步时，就害怕吸取残余乙醇时会把修饰纯化好的DNA吸走，请问你们是这么做这一步的呢？至今我还没有P出自己的目的条带，急啊，还有，我用的是普通的TAq酶，有影响吗？
33号 (2015-8-01 16:04:31)
QUOTE:
我用的试剂盒跟你的不一样，所以你说的这个我就不知道了。没有P出目的条带原因很多，引物是很重要的，建议最好换成热启动酶，这样分析原因也少了个因素。dior (2015-8-01 16:04:49)
wanglaoshi (2015-8-01 16:05:09)
另外想问下大家，用过5-Azacytidine这一DNA甲基转移酶抑制剂么？都用什么溶剂溶呢？我查的文献有提到用醋酸溶，PBS。但是看到cuturl('http://www.majorbio.cn/NewsInfo.asp?id=237')上关于5-Azacytidine的介绍上提到 Aza-C为白色针状结晶，溶于水，在酸和碱中易水解。所以文献跟这个是不是存在冲突呢？还是说虽然有易水解这一缺点，但是其有在酸碱中更易溶这一优点？所以就视缺点不见，从优了？
wanglaoshi (2015-8-01 16:05:29)
QUOTE:
很惭愧，我用的是Qiagen的甲基化试剂盒，柱式的，简易型，整个过程只需6个小时左右。所以就没有你说的这些状况了。我用的takara的热启动酶，好像500左右，也是别人推荐的，自己用着感觉也蛮好~呵呵【求助】MSP电泳图结果 求解