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【求助】引物设计如何选择基因序列？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2016-2-08 22:33    作者: 穿越时空    来源: 分析测试百科网

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【求助】引物设计如何选择基因序列？

我需要给人内皮细胞生长因子受体FLT-1设计引物，在GENEBANK上搜索到了几百条序列，有人的，有动物的，有 complete cds，有partial cds，我没有仔细看，也看不完，我只选第一条，是人的， complete cds，可以吗？
第一次自己设计引物，没有师兄师姐带，请各位帮帮忙吧。来长沙玩我请客。
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  • 穿越时空 (2016-2-08 22:34:54)

    共4017个bp,CDS是1~4017，是不是说整段都是编码区？ 编码产物是不是有4017个bp？太长了吧？

  • ##蒙奇奇 (2016-2-08 22:35:11)


    呵呵，我喜欢用编号M或NM打头的，它们一般比较好，因为我发现这类序列被研究工作者使用（论文引用）的频率明显比其他序列要高，其中我比较过一个序列，发现70篇对6篇的引用频率。编号M或NM打头的，所以我认为它们的可信度高。
    M打头的为DNA序列
    NM打头的为 mRNA序列
    另外你搜索的时候 多加几个限定词，如果你要人类的，你可以加Homo sapiens（智人，指现代人，拉丁文），那么其他种类动物，植物的序列就不会出现了。
    如果序列没大问题，cds也应该没问题，不过确实有点大。你可以发过你序列号让我查查看吗？或者告诉我你查的基因英文名给我查查看看吗？

  • qqshepherd (2016-2-08 22:35:28)


    建议你用DDBJ数据库,比较贴近中国人.最好找出编码基因所在的染色体,及外显子几号或内涵子几号,尽量缩小范围.这是我自己摸索的,我也和你一样没有师兄姐指点.

  • 穿越时空 (2016-2-08 22:36:02)

    你好。
    human vascular endothelial growth factor receptor -1（VEGFR-1或FLT-1）。
    我看到国内有人做过，产物是500多个bp，怎么我查的有这么多呢。我买的marker是1000的。希望产物不要太大。帮我查查吧。其他朋友有空的话也请帮我看看吧。谢谢。我自己也会去查的。

  • milkdog (2016-2-08 22:38:34)


    1、我想你要找的应该是人FLT-1的mRNA序列，那用NCBI的GENE来搜索吧，几分钟就能搞定。在搜索结果中，你所需要选择的就是物种和基因名称，然后点击相应连接就能找到你需要的序列，所以根本不需要你去考虑该选择哪个序列。NCIB的GENE所给出的Reference Sequences (RefSeq)一般都是以“NM”开头的；如果你还要找基因组DNA序列、蛋白序列和PCR引物等，里面都有相应的连接，打开就行了。
    2、人FLT-1 mRNA序列的CDS确实有4017bp。别人的产物为500多个bp，我想他是检测FLT-1的表达吧，他所扩增的只是CDS的一部分或mRNA序列的一部分。不知道你设计引物的目的是什么？如果也是要检测表达的话，那根据基因序列设计引物就行了，产物可以是100多bp，也可以是200-500bp，或者500-800bp也行，这些都得根据你的实验方法、实验要求等来确定。如果你想扩增整个CDS的话，那产物的长度至少也有4017bp，你的MARKER就没什么用了。

  • 穿越时空 (2016-2-08 22:38:54)


    谢谢楼上几位热心的朋友。
    我似乎有所领悟了。我做的也是检测FLT-1的表达。我希望产物500~800bp（这样就不浪费MARKER了），那么我应该在Primer Premier 5.0中输入哪一段CDS呢？

  • uaubc (2016-2-08 22:39:32)

    你把CDS全序列输入自动生成引物，看一下产物多长再说，不符合你的实验要求的话再在CDS里选择一定序列设计。

  • remonte (2016-2-08 22:39:47)

    认为应该输入尽量最长的序列，这样再自动生成引物时，可更多的发现错配。

  • 穿越时空 (2016-2-08 22:40:08)


    可是这样的话产物不是很长吗?有4000多!我不需要这么长的产物啊。
    请各位帮帮忙吧，这个问题不解决，没办法进行下一步实验。

  • eric930 (2016-2-08 22:40:28)

    个人觉得在用软件（如Primer Premier 5.0）设计引物时，你的模板还是用FLT-1 mRNA全序列比较好，因为这样对引物的分析会更准确、全面些。
    要控制产物的长度很简单，按如下步骤就能搞定。
    1. 在Primer Premier 5.0中拷入FLT-1 mRNA全序列。
    2. 点击“Search”。设定上、下游引物的范围，如果要在CDS中设计引物，则可将上、下游引物的范围设为250-4266（人FLT-1 mRNA序列的CDS为250-4266）；确定产物的大小，如果希望产物的大小为500-800bp，则可在PCR产物大小选择框中将产物大小限定在500-800bp之间（见下图）。
    3. 然后点击“OK”进行引物搜索，在软件自动搜索到的引物对中选择相对较好的引物对就行了。
    4. 如果软件自动搜索到的引物都不太理想的话，可以利用软件、根据引物设计原则，在所设定的引物范围内（如mRNA序列的CDS中），采用手工的方法分别寻找更理想的上、下游引物并使所扩增的产物大小达到你的要求。


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