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荧光光度法测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（一）
关键词：国家一级标准物质 国家环境标准物质 煤炭石油标准物质 中检所对照品荧光光度法测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（一）
【实验原理】
NAG催化4-甲基伞形酮-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷水解，生成产物4-甲基伞形酮(4-MU)。后者在碱性条件下变构，在364nm激发光照射下，发出448nm发射光，根据荧光强度，计算出酶活性。
【试剂与器材】
1. 枸橼酸-磷酸盐缓冲液(30mmol／L枸橼酸，47．5mmol／L磷酸盐，lg／L牛血清白蛋白，PH4．5)。
(1)60mmol／L枸橼酸溶液：称取含有一个结晶水的枸橼酸(C6H8O7·H2O，MW210)12．6g，用重蒸馏水溶解并稀释至1L。
(2)95mmol／L磷酸氢二钠溶液：称取无水磷酸氢二钠(Na2HPO4，MWl42)13．5g，用重蒸馏水溶解并稀释至1L。
(3)取(1)液50ml及(2)液50ml，混合，其pH应为4．5。
(4)取(3)液50ml，加入叠氮钠(NaN3)10mg及牛血清白蛋白50mg，溶解，4℃保存可稳定数周，如出现混浊，需重配。 。
2．2mmol／L底物缓冲液称取4-甲基伞形酮-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MW379．88)7．6mg，溶于10ml含有牛血清白蛋白的枸橼酸．磷酸盐缓冲液中，小量分装于具塞试管中，置-20℃保存可用数周，但不能反复冻融。
3．0．2mol／L pH 10．7甘氨酸-氢氧化钠缓冲液称取甘氨酸(WM111．5)22．3g，溶于约500ml重蒸馏水中，加入2mol／L氢氧化钠溶液126ml，并调pH至10．7，然后加重蒸馏水至1000ml，此液为酶促反应终止液。
4.300μmol/L 4-甲基伞形酮标准溶液 称取4-甲基伞形酮(C10H8O3，MWl762)13．22mg，用0．2mol／L甘氨酸一氢氧化钠缓冲液溶解并稀释至250ml，此为贮存液。置棕色瓶4℃暗处保存可稳定2周。
【操作步骤】
l.标本处理血清用不含牛血清白蛋白(BSA)的枸橼酸．磷酸盐缓冲液作20倍稀释；尿液用重蒸馏水作20倍稀释。
2混匀，采用激发光波长364nm，发射光波长448nm，以标准曲线管6号管(6 μmol／L，4-MU)调节荧光强度至100后，分别测定空白管及测定管的荧光强度。根据需要，亦可用标准曲线3号管(3μmol／L，4-MU)调节荧光强度至100。
标准曲线制作：取浓度为300μmol／L的4-MU标准液lml，用0．2mmo1／L pH 10．7氧化钠缓冲液稀释至50ml，得浓度为6μmol／L的4-MU标准应用液，然后按表操作。
激发光波长364nm，发射光波长448nm，用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液调零，6号管调节荧光强度至100后，读取各管荧光强度，在坐标纸上绘制标准曲线。
荧光分光光度法测NAG标准曲线制作
管号
加入物 1 2 3 4 5 6
6μmol／L，4-MU(m1) 1 2 3 4 5 6
甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(m1) 5 4 3 2 1 0
相当于4-Mu浓度(μmol／L) l 2 3 4 5 6
单位定义：37℃反应条件下，lL血清或尿液NAG催化底物4-甲基伞形酮．N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷水解1分钟产生1μmol 4-Mu为1个国际单位酶活性(U／L)，为避免尿液的浓缩或稀释影响，以同一份尿液中的肌酐浓度校正酶活性。
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