【转帖】【求助】血管平滑肌细胞培养

最新回复

• 04906 (2014-8-02 15:39:09)

  
  我做兔胸主动脉的，比大鼠和小鼠的好做的多!但应用受限!建议你选择人的!

• 00无名指00 (2014-8-02 15:39:27)

  
  我做过大鼠的,取其胸主动脉.

• 3N4G (2014-8-02 15:39:56)

  我做过大鼠基底动脉平滑肌细胞的培养

• PINK (2014-8-02 15:40:17)

  
  我用组织贴壁法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,今天是第三天,我忍不住拿出来看了一下,细胞没长出来,但是有很多亮晶晶的小圆点,放大以后仔细看,发现它好象在动.它们增殖得很慢,培养液没有变黄,也没变浑浊.我做之前所有器具都经过热压灭菌的.那些小圆点是细胞吗?Question

• kswl870 (2014-8-02 15:40:42)

  
  平滑肌细胞是梭形或柳叶状，不会是小圆点

• pencil菲 (2014-8-02 15:41:02)

  
  我帮师姐养过原代大鼠血管平滑肌,状态好的平滑肌看不清细胞轮廓,很饱满.但是状态不好的时候,边界就清晰了,可以看到成梭状,或者说拉网状.大鼠的血管平滑肌原代好培养一些,小鼠的一直没做出来.

• xueyouzhang (2014-8-02 15:41:19)

  
  具体的方法：（我曾经在硕士时养过二百瓶左右，有问题尽管问）
  原代培养：
  清洁级180-220g SD大鼠，断头处死，无菌操作取一段胸主动脉，洗去血液，去除外膜纤维脂肪组织，用眼科剪纵行剪开血管，刀片刮血管内膜2~3遍，然后将血管切成约1mm2大小碎片，分装贴入培养瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培养基，倒置3~4小时后翻转，于37% 5%CO2的细胞培养箱中静置3天(静置期间不许震动或移动培养瓶, 以防刚贴壁的组织细胞块脱落)，然后每2天换液。一般4~7天左右平滑肌细胞从组织块中爬出，2~3周出现致密细胞层。 待细胞快融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代，取3-8代细胞做实验。
  细胞传代：
  将原代细胞培养瓶中的培养液吸出, 加D-Hanks液到瓶中清洗细胞表面2次。弃掉清洗液， 加入0.25%胰蛋白酶1.0 ml, 将消化液均匀覆盖细胞表面，消化时间为2~4 min。这时在倒置显微镜下观察, 可见细胞成片皱缩变圆，细胞边缘折光增强。在细胞未脱落前倒去消化液，立即加入血清或含血清的培养基以终止消化。然后用滴管将细胞从培养瓶壁上轻轻反复吹打下来。然后根据细胞密度, 以1: 2~4分瓶培养。每2~3天换液, 待细胞生长到接近融合时(一般为7~10天)再传代。
  注意要用Actin来鉴定一下，不然人家不信你的。

• zzzz (2014-8-02 15:41:45)

  
  我养的血管平滑肌细胞传代以后总是好几个细胞聚在一起,一团一团的,贴壁以后象一朵一朵的菊花.请教各位这是啥原因?怎样才能改善?

• koook5695 (2014-8-02 15:46:48)

  
  细胞消化不充分，没有吹打成单细胞时会出现这种情况。

• douding66 (2014-8-02 15:47:25)

  
  你好,我是平滑肌细胞培养的新手,我严格按照书上写的做,和你做的也差不多,细胞就是长不出来啊.和你做的不同之处就是:我用PBS液清洗外膜.我用镊子头刮的血管内膜,我的困惑就是用一次性塑料瓶就是不知道怎么铺匀,因为做了几次用滴管铺的发现把瓶底磨毛了.现在都是徒手摇匀的.但是不是很匀.
  我用玻璃瓶养但听说不容易长.铺匀倒是没问题.
  目前有一瓶是第6天了,细胞倒是长出来了,就是很少啊,就零星几颗,我是怕细胞长不满啊.

• PPT (2014-8-02 15:47:50)

  
  请问，酶消化法什么时候换液比较好？

• Ao7 (2014-8-02 15:48:20)

  
  请问,有人做小鼠SMC吗,我做小鼠的肠系膜上动脉SMC,现在能够张出细胞,但是细胞生长很慢,2个月后才能到大瓶水平(7代左右),而且对epinephrine,angiotensin等刺激在calcium和myosin light chain phosphorylation上没有反应. a-actin染色阳性还是比较高的.
  (个人感觉细胞的形态千差万别,圆形的索性的网状的,在不同的代数能见倒不同的类型,所谓波峰波谷也只有在细胞张的很满的时候,加上自己的想像才能看见T0T)
  请问
  1.酶消化过度是否会产生能存活但是生物学特性受损的细胞.
  2.smc一般要求3-8代之内用,那大致是多少时间呢?时间太久的体外培养会导致细胞表型的改变.
  3.成纤维细胞或者内皮细胞是否存在a-actin染色弱阳性?
  谢谢各位

• sunshine039 (2014-8-02 15:48:49)

  我养的血管平滑肌细胞传代以后总是好几个细胞聚在一起,一团一团的,贴壁以后象一朵一朵的菊花.我想请教一下这是啥原因?怎样才能改善?
  
  ============================================================================
  
  恭喜你，那是因为平滑肌细胞生长时具有峰谷状，说明你培养的是平滑肌细胞，而不是成纤维细胞。

• 天蝎座 (2014-8-02 15:49:23)

  平滑肌细胞贴壁培养前三天不动它，到了第6、7天细胞才会长出来，有时候没有看到细胞并不是真的没有细胞，细胞可能在组织块下面而看不见。死细胞一般漂浮，园且折光好

• nut6694 (2014-8-02 15:49:48)

  
  我做过大鼠脑血管SMC，在培养皿铺上Matrigel，细胞长得还可以，就是不知道为什么传代就不长了，请教高手指点。谢谢。

• 脱水萝卜 (2014-8-02 15:50:20)

  因为最近看到不少战友需要培养血管平滑肌细胞，存有不少这样那样的问题，大伙把问题放在这里一起讨论吧。
  年年岁岁人不同，岁岁年年细胞相似。

• 脱水萝卜 (2014-8-02 15:51:18)

  
  我最近也是在用植快培养法培养细胞，但是我觉得原代操作中， 剥离动脉外膜和如何纵行剪开血管， 是比较复杂的操作， 有哪位高手，指点迷津，谢谢了！

• orangecake (2014-8-02 15:51:33)

  
  我帮师妹剥离过动脉外膜和纵形剪开血管，我第一次做就剪的很漂亮，要用纹丝钳和眼科剪，还有前面弯头的小镊子。剥离动脉挺费时，等慢慢一丝一丝的剥，但也不难，至于剪血管就很容易了，你用钳子钳夹住一端的血管壁，眼科剪伸进血管，就像裁缝剪步那样就一溜全剪开了。我说了半天不知道你明白么，还是要自己琢磨，熟练就容易了！

• orangecake (2014-8-02 15:51:58)

  
  我们培养血管平滑肌采用的也是组织块法，尝试想用消化酶消化老养不成，但组织块法从组织块爬出细胞挺费时间，要好几个礼拜，一旦细胞传代后速度就快了，方法和上面说的差不多（北国木棉）但是我们胰酶浓度用的0.2％的，可供大家参考，还用双抗液用的浓度100U/ml。下面是一张组织块周围爬出的细胞。

• 箭头儿 (2014-8-02 15:52:53)

  我养的血管平滑肌细胞传代以后总是好几个细胞聚在一起,一团一团的,贴壁以后象一朵一朵的菊花.我想请教一下这是啥原因?怎样才能改善?
  我在培养平滑肌细胞中也遇到过这种情况，开始也不解，以为是长成了组织块，后来就知道是消化收集离心后重悬时没有完全吹打散开，所以就成了细胞团，种植贴壁后细胞就从团中爬出来，所以成了菊花样。下次吹散时吹久些，就解决了。祝你成功！