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【求助】细胞复苏不成功

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2015-4-06 17:20    作者: 逗号是句号    来源: 分析测试百科网

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【求助】细胞复苏不成功
各位大侠，请指点一下小妹！
我把细胞从-80度的冰箱拿出来复苏，期间没有污染，放二氧化碳孵箱后第一天在显微镜下看，发现很多漂浮的死细胞，贴壁的细胞很少，但培养液是清亮、桃红色的，液面上可见漂浮着很多死细胞（我用的是DMEM+10%胎牛血清的培养液）；我又把它放回孵箱；第二天看，和第一天一样，我就换液了；第三天看，镜下基本未见什么细胞了。之前师兄给我说这种细胞长得慢（甲状腺癌K1细胞），但是不至于不长，说明没有复苏成功。
请大家帮我看看，我是不是哪里出错了
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【求助】细胞复苏不成功

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最新回复

  • mimili_901 (2015-4-06 17:20:26)

    可能的原因有：
    -80度冻存细胞的时间太长，一般如果需要长期保存的话，超过一个月。最好转入液氮。
    原有的冻存细胞状态就不好，表现为细胞活力不够，细胞密度不高。
    换液太快，培养体系太大，如果细胞状态不好，最好保持较小的培养容积，以获得较高的细胞密度。如果培养基还是桃红色，说明细胞的代谢活动很弱，此时不宜换液。

  • xue258 (2015-4-06 17:20:59)


    10ml冻存的，现在复苏就用5ml，不知道你这个细胞是喜欢聚集生长还是离散生长。根据条件调节。比如，如果喜欢聚堆长，建议先倾斜培养瓶/皿，2h为一个时间间隔，观察细胞状态，以作调整。

  • 101010 (2015-4-06 17:21:16)

    估计是细胞在冻存时消化过度，导致细胞状态不好。

  • veiwu (2015-4-06 17:22:25)

    如果第一天能见到贴壁的话,说明还是可以的.有时候培养基颜色偏紫,细胞贴壁会有问题的.你核实一下你培养基颜色是否偏碱.如果偏碱,可以适当调高培养箱二氧化碳的浓度.或者换新的培养基.特别是开启过的培养基,适用时间长容易出现这个问题.

  • shenkunjie (2015-4-06 17:22:42)

    我也遇到以上情况，根据经验很多次像这样的情况都是细胞冻存过程出了问题，另外复苏细胞溶解要迅速，我们有时候水浴锅跳刀38度，甚至40度，目的是让其快速解冻，而且复苏第一次的培液血清浓度可以相对我高一点，等第二次换液时换回10%。个人见解，仅作参考。

  • 逗号是句号 (2015-4-06 17:23:05)


    谢谢楼上各位的回答！
    后来我又换了瓶细胞来复苏，这次这个细胞就是从液氮罐里取出来的，按照之前的操作，这次的细胞就活了，而且很快贴壁生长，说明之前的细胞当时冻存时状态不好，放-80度冰箱时间太长了。

  • feiya (2015-4-06 17:23:32)

    应该是冻存的问题

  • vvmmoy (2015-4-06 17:23:46)

    学习了，也可能是复苏时时间控制不好，冻存管中细胞转移到离心管时，要先打均，因为可能有些细胞会附在壁上；转移到离心管时，加10倍体积的含10%FBS的DMEM时，前几滴要加慢点，同时要稍微震荡。另外，接种在培养瓶中的细胞最好是5*10的五次方。

  • vvmmoy (2015-4-06 17:24:09)

    如果第一天能见到贴壁的话,说明还是可以的.有时候培养基颜色偏紫,细胞贴壁会有问题的.你核实一下你培养基颜 ...

    ===============================================================================

    我昨天下午刚复苏了一个细胞，也有一大部分没贴壁的，培养基还很红，不知道今天早上该不该换液？

  • ending (2015-4-06 17:25:19)

    QUOTE:

    原帖由 vvmmoy 于 2015-4-6 17:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    如果第一天能见到贴壁的话,说明还是可以的.有时候培养基颜色偏紫,细胞贴壁会有问题的.你核实一下你培养基颜 ...

    ===============================================================================

    我昨天下午刚 ...
    复苏的细胞有一部分是不成活的,因此会有一些细胞在随后的培养中死亡变成碎片而消失,同时活的细胞会不断增殖,如果你能看到一部分细胞贴壁了,培养基颜色正常,可以考虑不换.如果细胞碎片非常多,培养24h后,轻轻晃动,把状态不好的细胞悬浮起来,换一次液

  • 49888 (2015-4-06 17:25:54)

    -80冰箱温度稳定么？ 冻存液有没有问题？ 我用的一般是FBS+10%DMSO  
    慢冻快复，复苏的时候把冻存管放在37°C水浴锅中快速摇晃，待冻存液化冻后加到适量medium中，低速离心后，吸掉多余液体，用枪吹匀底部细胞，加到dish里

  • u234 (2015-4-06 17:26:24)

    QUOTE:

    原帖由 49888 于 2015-4-6 17:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    -80冰箱温度稳定么？ 冻存液有没有问题？ 我用的一般是FBS+10%DMSO  
    慢冻快复，复苏的时候把冻存管放在37°C水浴锅中快速摇晃，待冻存液化冻后加到适量medium中，低速离心后，吸掉多余液体，用枪吹匀底部细胞，加到dish里 ...
    长虫子了，我丢了，可能那一批都不行，后来我又复苏了一个，就好了，3q

  • S6044 (2015-4-06 17:26:47)

    不知道楼主你冻存的时候是不是慢冻，我一般是先放4°冰箱30-60min，再放-20°冰箱30-60min，再放-80°冰箱，至少过夜后放液氮罐里。

  • dog002 (2015-4-06 17:27:14)

    1冻存，放液氮，2复苏细胞状态不好不要换液，3体系不宜过大

  • vvmmoy (2015-4-06 17:27:32)


    我个人觉得应该是冻存的细胞有问题,如果还有同一批次的,建议再复苏一株,看是不是都有这样的问题

  • zhy平平 (2015-4-06 17:27:53)

    是的 因为冻存液中血清含量高，所以刚刚复苏时培养液中血清的浓度要高些
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