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【求助】PCR条带很暗，且杂带很多！怎么办？
我已经做了三个多月的PCR了，但条带一直都不好，目的条带很暗，而杂带却很多而且比较亮，什么原因呢？我调整了好几次条件都是这样的，杂带总是去不掉，而且目的条带很暗很暗，我都快急死了！【求助】PCR条带很暗，且杂带很多！怎么办？
我用的体系是25 ul，各成分为：模板（浓度为60ng/ul）1ul，Mg2+1.5ul(终浓度是1.5mmol/l)，buffer2.5ul，dNTPs0.5ul(终浓度为0.2mmol/l)，引物各2.5ul（终浓度为0.5pmol/ul）,Taq酶0.2ul(终浓度为1U)，补充ddH2O至25ul。
PCR程序为：95度，5min；94度30s，58度（退火温度）30s，72度30s，35个循环；72度延伸7min；4度保持。
应该是条件还没摸好，但我的确不知该从哪里下手，还请各位不吝赐教，感激不尽！
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【求助】PCR条带很暗，且杂带很多！怎么办？
最新回复
yyaxw84 (2016-2-08 22:42:01)
yyaxw84 (2016-2-08 22:42:24)
还有加样要快，在冰上，祝你成功！
mybioon (2016-2-08 22:42:43)
目的条带很暗，而杂带却很多而且比较亮
1.依你所说,估计杂带都是比目的条带小,PCR倾向扩增小的片段,所以杂带比较亮.那莫你的问题应该出在引物设计上了,你所设计的引物在目的片段内产生了非特异配对,最好是重新设计一下.
2.优化一下也可以.可以试试退火温度60左右,再高一点也可以.模板,引物可以提高一些.Mg2可以试试1.0mmol/l
3.另外,要看你的实验目的,你目的是要克隆的话,其实没必要刻意去优化,有带就可以了,割胶回收就ok了.
ending (2016-2-08 22:43:15)
呵呵,你这个问题我以前遇到过,把一些经验贴上,可能不一定适合你,仅仅供参考
0.优先使用温度梯度,不过我觉得你已经做了3个月了,这个方法也一定适过了,呵呵,所以标为 0
1.如果杂带多,一个非常好的方法是TOUCHDOWN PCR,这种方法非常适合杂带多的PCR,主要步骤(比如你的退火温度为 56度)为你退火的温度设置为68度,每度降低0.5度,16个循环后到60度,再用56度扩增20个循环;
2.增加添加剂可能有所帮助,我们很多成功PCR都是这样加添加溶剂做出来的.你可以做平行样,分别添加1)8%DMSO 2)4%甲酰胺 3)5%甘油,其中加前2者效果尤其明显,最后选择最适合的方法.
3.把方法1和2结合起来.
4.引物设计,是不是能换一个更好的引物?你可以把你的引物和序列发上来给你分析一下
5.bty,你的体系没有什么问题的
tewank (2016-2-08 22:43:36)
你扩增的什么东东哦？30s?如果你的引物没问题，那你的问题就是一个提高特意性。提高复性温度，减少模板，引物，酶量都可以。
伊莎贝拉 (2016-2-08 22:43:53)
杂带比目的条带大，我的目的条带是284bp，而杂带基本在1000 bp以上，而且都是两条，还很清楚！我优化了几次条件，但杂带还是在，还是两条，还挺漂亮的呢，好顽固哦！
wanglaoshi (2016-2-08 22:44:10)
引物设计有没有进行特性性比较？
伊莎贝拉 (2016-2-08 22:44:34)
引物怎么进行特异性比较呢？我都不知道怎么比较？
baidukk (2016-2-08 22:44:50)
不要花费时间了，赶快更换特异性强的引物。祝你顺利！
伊莎贝拉 (2016-2-08 22:45:14)
我用的两对引物序列如下：1，F：5‘-ACTGCTACCTGGCCTGAC-3’
R：5‘-GGAATGTGACAACGCTAA-3’
2，F：5‘-GGATGGGGGAAGTATGGG-3’
R：5‘-ATCGGTGGCTAGGCTGAA-3’
楼上transhold ，请问我该怎么进行特性性比较？能帮个忙吗？先谢谢了！
vcve (2016-2-08 22:45:47)
光给出引物是没办法进行特异性比较的，建议你重新设计了，换家纯度高质量稳定的单位
milkdog (2016-2-08 22:46:09)
光给出引物是没办法进行特异性比较的，建议你重新设计了，换家纯度高质量稳定的单位
seagate (2016-2-08 22:46:33)
总dNTP浓度在0.7～0.8mM，Mg2.0mM时激活Taq酶能力最高！！！再试试看！
伊莎贝拉 (2016-2-08 22:46:51)
我把体系换成50了以后，加的各种试剂的量是否是加倍呢？
lagua123 (2016-2-08 22:47:11)
我把体系换成50了以后，加的各种试剂的量是否是加倍呢？
不能这样做，体系加倍以后，打个比方，升温到94度时间相应就要延长，降温时间也要相应延长，等等，参数都要变，不是*2就行的
伊莎贝拉 (2016-2-08 22:47:36)
哦，是这样啊！那我应该做怎样的改变呢？延长的时间有没有什么固定的规律呢？各个参数应该做怎样的变化呢？
【求助】PCR条带很暗，且杂带很多！怎么办？