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【求助】血液中提取总RNA
论坛里有没有前辈用红细胞裂解液来提白细胞的。之前有处理过一批人骨髓的标本,用红细胞裂解液提的白细胞后,加入1000UL TRIZOL ,放入-80℃保存。积累了一批标本之后整体提RNA,逆转录,电泳。最后做的PCR,可是PCR出来的结果一直很不理想。【求助】血液中提取总RNA
想请教前辈,用裂红提取白细胞这一个过程是需要无酶操作的吗?还没加TRIZOL裂解白细胞之前,细胞里面的RNA会被降解吗?网上有查到一站式提取血液中总RNA的试剂盒,不知有没有前辈用过,这种方法成熟吗?有没有资料可以比较一下这些方法提出的RNA的质量?能不能给点意见,我们有没有必要换一种提RNA的方法呢?
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最新回复
盼盼 (2016-4-08 14:45:45)
还有很多战友提到的淋巴细胞分离液是怎么用的呢?跟红细胞裂解液有什么差别?
831226 (2016-4-08 14:47:55)
RNA会降解的,尤其是血液取样的时候杂质较多,需注意无酶操作
试剂盒只是使用方便,效果未必比试剂好
低温保存的样本仍有降解可能,尤其是反复解冻
建议提出来后跑跑rna,看看条带怎么样,这样可以排除逆转录出问题的可能性
wawa (2016-4-08 14:51:37)
我们公司有血液RNA提取的Kit(目录号RK206),全血(不是白细胞)直接加入2.5倍试剂,室温放置2小时,这个过程缓慢裂解所有细胞(包括白细胞),试剂中含阳离子多聚物能屏蔽DNA和RNA的负电荷,使DNA和RNA析出,与RNase隔离。每毫升血液产量约3-8ug RNA。如果不立即提取RNA,可以室温放置24小时,4度放置1周,-20度长期保存。
盼盼 (2016-4-08 14:51:59)
QUOTE:
您的意思是在提取出RNA之后可以跑一跑胶,看看条带吗?我们实验室的师姐之前做的时候都是在逆转录出cDNA之后跑的胶。这样子有什么差别呢?盼盼 (2016-4-08 14:53:25)
QUOTE:
有没有文献提供,可以比对一下你们的试剂跟传统的全血中提RNA方法的效果?跟传统全血提RNA方法相比,你们试剂的优势主要体现在哪些方面?=菓子= (2016-4-08 14:53:46)
ns5fan (2016-4-08 14:54:03)
直接跑RNA,这样可以观察到RNA的质量,然后决定是否进行逆转录。这样可以节省人力和财力
laughing妹 (2016-4-08 14:54:21)
2 红细胞裂解液中的成分会影响得率
3 可以将100ul骨髓加1mltrizol直接混匀后保存于-20度提取,效果不错,可以一试
盼盼 (2016-4-08 14:54:46)
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我跟师姐说过,想要先跑一下RNA,看看RNA质量怎么样,再决定是否逆转录。但是因为我们做的是临床上病人骨穿后取的骨髓血,病人的标本都是很珍贵的,所以师姐建议我要跑RNA可以拿养的细胞来跑。师姐说如果细胞的RNA跑出来结果是好的,就可以了。但我觉得每个病人是不一样的,而且骨穿的标本是临床上给的,我们实验组的人,并没有在临床上,所以拿到标本的时候,一般都是骨穿过了好几天之后了的。虽然我们提RNA用的是相同的方法,但提出来的RNA的质量,对每个病人而言,都是不完全一样的。
盼盼 (2016-4-08 14:55:38)
QUOTE:
师姐的意思的临床上的标本很珍贵,为了节省标本的损耗,建议我们不跑RNA...前辈,有没有自己做过的提取骨髓血或外周血中总RNA的方法提供参考呢?
盼盼 (2016-4-08 14:55:56)
2 红细胞裂解液中的成分会影响得率
3 可以将100ul骨髓加1mltrizol直接混匀后保存于-20度提取,效果不错,可以一试
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有没有什么方法可以尽量减少红细胞裂解液对得率的影响呢?
盼盼 (2016-4-08 15:00:07)
33号 (2016-4-08 15:00:31)
前辈,有没有自己做过的提取骨髓血或外周血中总RNA的方法提供参考呢?
当时我们提取的是外周血的总RNA,感觉提取的质量要比组织的RNA还要差一些。所以我才建议你第一次提的时候跑RNA
既然标本这么珍贵,为何不用非标本血液提下RNA练习下基本技术呢
如果之前你们师姐按这种方法已经成功提取过RNA并扩增,这就没问题
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但是如果仅仅停留在理论阶段,建议还是试试
不然实验不顺利,根本不知道哪个环节出了问题
轰轰 (2016-4-08 15:01:18)
我们经常提取的,我上面描述的方法比较可靠的,全血最多加150ul/1ml Trizol,不必裂解红细胞
vcve (2016-4-08 15:01:49)
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赞成!!Trizol说明书上明明白白写着可以这么操作的,方法简单可靠,但是那个Trizol要注意了,其具体型号是Trizol LS Reagent,专门用来处理液体样本的,这种方法尤其适用于小体积样本,方法越简单越好,出错的机会越少。
少林弟子 (2016-4-08 15:02:13)
QUOTE:
Trizol LS Reagent优势在哪里?用过国内的,差不多any333 (2016-4-08 15:03:04)
Trizol LS Reagent其实成分和Trizol Reagent是一样的,只是因为处理的是液体样本,所以把Trizol的成分浓缩了一下,这个Trizol LS Reagent优势就在于这是一种大品牌,国际通用哈哈,很多人都用,国内的试剂可能效果也差不多,只不过总给人一种不可靠的感觉。
13775112843 (2020-2-17 14:07:32)
【求助】血液中提取总RNA