【求助】做WB蛋白浓度低怎么办？

最新回复

• xyw5 (2014-5-29 17:09:25)

  用5XSDS上样缓冲液，这样蛋白样品和缓冲液比例是4：1；还有就是煮沸蛋白变性的时候可以适当打开EP管盖，让水分挥发点，WB还是比较灵敏的，所以不要太担心

• 大尾巴 (2014-5-29 17:09:48)

  蛋白样品和缓冲液最大量能加到多少微升？我以前都是加到25ul，二者比例20:5. 另外，煮沸让水分蒸发会不会影响二者的比例，影响跑胶的效果？还有，WB要求蛋白质量最少是多少？我刚开始做WB，很多不懂，请不要见笑！
  谢谢！

• mickeylin (2014-5-29 17:10:05)

  
  好象可以检测到钠克级
  建议用发光法显色，较DAB显色提高1000倍灵敏度

• cwcwcww (2014-5-29 17:10:22)

  
  最主要是你在提蛋白的时候裂解液可少加点，这样可以提高总蛋白的浓度，OD值在0.6左右太小了，直接会影响到你下一步加样时上样量的大小，要是需要大点的上样量的话，上样孔会负载不了。可用10×buffer的上样缓冲液，可使体积更小点儿。0.2um的PVDF膜可检测到2～5ng(影响中是）的蛋白，但是总蛋白的上样量需要摸索（根据目的蛋白的表达量），楼上战友说得对，用ECL比DAB灵敏的多，如果你的上样量不足，最好还是用ECL检测。

• summerxx (2014-5-29 17:10:39)

  你的od值0.6难道是没有稀释的原液，那也太小了啊！不过用化学发光法应该还有可能做出来。试试才知道。

• bangqi_k (2014-5-29 17:10:56)

  找不到怎么办？

• 小野花 (2014-5-29 17:11:12)

  
  除了wgqsdams 的建议之外，还有一个方法，如果上样量太大，一次上不了，可以先上一部分，等跑下去一点之后再加，反正要经过浓缩胶浓缩的，不会有影响。

• sunnyB (2014-5-29 17:11:31)

  使蛋白浓度增高还有一个办法，就是使用冻干机使蛋白浓度提高。呵呵，不过这种方法很昂贵啊，如果实验室有可以试一试是可行的。wgqsdams 战友说的有道理，在提蛋白的时候裂解液可少加点，这样就可以提高浓度了。还有一个办法就是用较厚的电泳玻璃片（具体的我记不清了，应该在1.5cm左右吧，我们通常用的是0.75cm的上样量25ul），上样量可以达到100ul。仅供参考，祝好运！！！

• 大尾巴 (2014-5-29 17:11:53)

  谢谢楼上给我战友的指点！
  我想每次提完蛋白后就定量，然后将计算好的蛋白量与缓冲液按4：1混合后煮沸，保存，下次做WB时直接拿来就可以了。这样有俩个好处：1避免蛋白降解 2避免每次做蛋白定量损失蛋白。不知这样做是否可以？保存温度？我问师兄师姐有的说可以有的说不行需现用现配，请指教！谢谢！
  l另外，10xbuffer是用来做SDS/PAGE的上样缓冲液吗？我知道的10xbuffer是DNA上样缓冲液啊！二者是否可以通用？
  祝各位战友一切顺利！

• xyw5 (2014-5-29 17:12:29)

  将蛋白提取后测完浓度就可以根据每次的用量分装保存了，保存在-80度的冰箱，每次使用时取一管，再加上缓冲液煮沸（煮沸也不是绝对的）上样。先加缓冲液煮沸后保存不太好，因为缓冲液里有SDS，低温下容易形成结晶，影响蛋白的变性。
  蛋白的buffer和DNA的buffer成分不一样，不能互用，10xbuffer只要在5xbuffer的基础上各溶质的量加倍就行了，这样可减少1/2的上样buffer,提高蛋白的上样量。

• 云端ing (2014-5-29 17:12:51)

  
  上冻干机应该也是一个好方法，现在很多实验室都有的

• damingxia0904 (2014-5-29 17:13:08)

  
  请问冻干机能直接干燥液态样品吗？

• IAM007 (2014-5-29 17:17:12)

  
  冻干是好方法！我做过培养液中细胞因子的WB，用冻干法效果不错，省得买ELISA盒子了~~：〉
  ps：冻干主要用于溶液的浓缩。

• abc816 (2014-5-29 17:17:41)

  
  我提个建议,大家看行不行.
  用20%的三氯乙酸(TCA)把蛋白沉淀,除去上清,然后加制样buffer,这样也相当于是浓缩了啊.

• popo520 (2014-5-29 17:18:00)

  
  有一种小型的超滤管(密理博),可以处理500μl到1ml的样品,离心后可以达到浓缩的效果;另外,如果蛋白浓度低,可以做厚一点的胶,比如BIO-RAD的0.75 mm →1.5mm.

• standbyme (2014-5-29 17:18:18)

  
  有一种小型的超滤管(密理博),可以处理500μl到1ml的样品,离心后可以达到浓缩的效果;另外,如果蛋白浓度低,可以做厚一点的胶,比如BIO-RAD的0.75 mm →1.5mm.

• zsxan1990 (2014-5-29 17:18:37)

  
  简单点的可以用丙酮沉淀过夜

• laughing妹 (2014-5-29 17:18:53)

  
  OD 0.6不低呀，不必浓缩了，电泳操作出问题了吧？

• laughing妹 (2014-5-29 17:19:10)

  
  OD 0.6不低呀，不必浓缩了，电泳操作出问题了吧？

• nvdabing (2014-5-29 17:19:28)

  
  浓度大概是1mg/ml吧．我最近正在做着方面的实验呢，大家互相交流吧