【求助】5‘RACE二扩弥散

最新回复

• 04906 (2014-9-24 11:07:07)

  重新提了5end的RNA，没做消化，没调浓度（大约2ug左右，纯度1.92）直接RT，今天又跑了一遍，二扩如下图：

  
  3.24 5'巢式第二轮.jpg

• 04906 (2014-9-24 11:07:30)

  求教：二扩是做了NUP通用巢式单引物做对照，两者都还是拖带，左边是样品，右边是单引物对照，除了引物可能特异性不强，我一扩是没有稀释加1ul直接二扩，是不是模板也比较杂，因为看到单引物对照也是拖带，想求这个的解释。。。程序依旧TD，72度延伸1min，最后一轮29个循环。
  
  附一扩结果，如下图

  
  3.24 5'巢式第一轮.jpg

• 04906 (2014-9-24 11:07:58)

  这个是RNA跑的胶，点了3微升：

  
  3.22 RNA.jpg

• kswl870 (2014-9-24 11:08:57)

  如果预测的待扩序列不超过1Kbp，就没必要用2min的延伸了，1min足够（普通聚合酶的延伸速度在60nt/s以上，高保真酶可能低些），延伸太久、循环数多，对酶活损耗大。
  
  单特异性引物扩增5'？楼主可否提供信息来源？很有兴趣探讨一下，呵呵。
  
  至于用不用touchdown或者touchdown的条件，甚至你要touchup都是可以不断尝试的，RACE看运气吧，有时候不稍半点功夫就成功，也有花了1年多2年的都钓取不出来的。
  
  至于模板，楼主可以用之前扩增中间片段的一个sense primer和现在扩增5'的antisense primer（或其他合适的引物）进行验证。

• leifengta (2014-9-24 11:09:21)

  
  我硕士阶段用的cloneteq的smart RACE,我没有用touchdown 不过也用的两轮扩增我的方法很好用~朋友拿这个方法都做出来了，第一轮只扩20个循环，退火温度65， 第二轮用第一轮的模板可稀释也可以不稀释，引物用inner的特异引物，5‘如果试剂盒里有inner的也可以换成inner的，这样两边都增加特异性，扩增30个循环足够了，至于退火温度可以摸索60-68，那个试剂盒要求68度的，延伸按照1min=1kb来算，看目的条带的大小。希望对楼主有帮助!

• 04906 (2014-9-24 14:47:52)

  非常感谢楼上两位！
  首先单引物扩不是用oligodG加通用接头的方式得到的专门5'end模板，而是用3'end的模板在PCR时接头再继续扩增。不知道这样说明白吗？只是稍有了解，但不是我实验室的常规做法，所以没深入。
  
  今天重新跑了一下，延伸调到1min，依旧拖带，试了一个比较久之前的没消化直接RT的模板，发现500bp左右有稍明显的带，但是拖带很严重，所以还是失败告终。
  
  我觉得还是模板的质量要求，明天重新手动抽RNA试试看。一切交托给命运，太悲摧了吧～

• 04906 (2014-9-24 14:48:23)

  实验室有LA，PCR仪也还不错，我想touchdown比较简略一点，引物的话已经完全按照touchdown的要求做，Tm拉高，基本也没看到缺陷，如果最终是引物问题，那rp是低到极点。至于跑胶拖带，实在找不到除了模板以外合适的说法，我想不稀释了，提纯下模板，有没有用？或者说，单从PCR的角度看，能否解释拖带的原因？如果重提RNA都出不来，那我没办法了…

• yayya (2014-9-24 14:49:53)

  
  我也做RACE，但是我都不懂什么touchdownPCR,一个师兄在林科院，我就用的师兄给我的程序做的，条带是有的，但是回收之后，经过一系列处理，去测序，怎么都不是我自己要的序列，几乎都是载体

• ladyhuahua (2014-9-24 14:50:52)

  
  lz，用td还要摸索条件根本没必要的，做5 race就是要多设计几对引物，然后做nested pcr，因为经常第一轮PCR都没有清晰的带，有这时间去td不如多设计引物～～
  另外，race'说明书提供的方法不一定好用，首先mRNA质量要好，其次做nested pcr，成功率还是很高的

• 04906 (2014-9-24 14:51:15)

  哟西，不是这样啦，只是一些小调整，还是touchdown+nestle解决问题。
  多设计引物么...我觉得设计得很好的引物假如模板是成功的话，应该可以连得上，因为引物在设计得好的基础上，成功与否关系就是模板质量和PCR的设置。盲目设一堆我觉得不如抽好一点模板。
  
  看来程序本身没什么致命伤，就是模板让人摸不着头脑，过了这一周看看新的模板怎么样吧～～
  5’end的毛病，完全非技术啊～～悲

• yueban-1147 (2014-9-24 14:51:47)

  
  一般设计三对引物，因为一次PCR时候程序对结果影响很大，但是nested pcr结果就很容易出来，设计多对的好处是，没必要在第一条外侧引物上费太多时间～～

• dodoit (2014-9-24 14:52:15)

  
  我也扩了N久了，同一批cDNA，其它人就能扩出来，我怎么换引物，怎么改条件都不行，真不知道是什么原因啊。。。。RP真的是低到极点了。。

• seagate (2014-9-24 14:52:42)

  几乎都是载体？没有插入序列吗，估计是没有克隆进去，测序之前最好检测一下，或者提个质粒，用质粒作为模板再PCR一下，保证有目的片段，我建议和楼下的一样，有时间去做TD还不如多设引物，PCR是否成功关键看引物，钓基因就是一个不断摸索引物的过程，不要去执着某一对引物，试不出来就换，别给老板省钱，最终做不出来还是害了自己的毕业。

• 04906 (2014-9-24 14:53:14)

  嗯，谢谢楼上几位的意见，但是我想没有人关注模板的质量？比如消化是否会对模板有影响？或者都已经站在模板无可挑剔的情况下谈操作？但是提mRNA不一定都是绝对完美的哟。明天重新提一次，不行再重设引物。
  另外有个关于3'end测序的小问题，为啥找不到polyA，其他部分都对了，难道我的序列有一部分与通用引物的序列是一样的？？cuturl('http://bbs.bbioo.com/thread-88092-1-1.html')
  测序公司说测通了，没发现问题，我的预计长度有900bp

• ALALA (2014-9-24 15:27:10)

  
  啊，我最近也在做啊，用的方法是cDNA 用TdT 加dCTP尾的，一次第一轮的时候还出来了带，但是不同基因带一样大的。。。还超出了预计的大小。。。。。。因为看的到，我就没做nest,  回收死活连不上T。。。。。。。
  今天做第二次，第一轮什么都看不见，除了引物二聚体，我退火用的55度的，想着直接第二轮nest好了，现在正P着。。。

• 04906 (2014-9-24 15:27:29)

  
  今天重新5endRACE，继续拖带，已经重新设计引物两对...
  
  主楼有更新，继续求教！！

• koook5695 (2014-9-24 15:27:49)

  
  lz,你的RNA降解有些严重~~~
  我看了你的问题。觉得有几点主要注意：
  目的片段多大
  5端是不是有局部高GC
  有没有试过一扩和二扩都用普通PCR（非TD）

• 04906 (2014-9-24 15:28:16)

  
  还没跑过带出来，目的带长度未知，大约会在5~700左右。
  
  看别的物种的确很多GC，不清楚这个的意思是指？
  
  没有试过普通，这个关系大吗？因为我的引物tm都设到68左右的。
  
  RNA这个...再提。

• koook5695 (2014-9-24 15:28:40)

  可以去订个GCbuffer，对于高GC较有用，其次如果做二次可以不用设置那么高的退火，我的引物TM都在七十五以上，根据试剂盒说的，但是实际我一般是六十度退火，退火太高，影响扩增效率
  

• 04906 (2014-9-24 15:31:59)

  
  谢谢LS一直提的建议！
  
  今天重新改过引物，把重叠序列加到500左右。这样估计目的带出来的话可能1000左右。希望可以降低错配等的几率，提高引物特异性。
  另外体系也改了一下。之前一直按平常PCR做的体系（之前UPM一直加的0.2...20微升体系）
  而巢式和热启动等我觉得已经针对特异性去走。
  下面再跑跑，回头再发上来。
  
  至于RNA，其实跑胶的情况和实际情况，我也说不准，尽量再完善一下吧。