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【求助】PCR延伸时间是不是和扩增片段大小有关?
【求助】PCR延伸时间是不是和扩增片段大小有关?
我在文献上找到的我课题的pcr反应条件,延伸时间只有30-40秒,是在外文文献上找到的,这个时间是不是太短了?我不敢按这个条件跑pcr.
请高人指点,谢谢!
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【求助】PCR延伸时间是不是和扩增片段大小有关?
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2015-7-02 22:15 作者: qhyu 来源: 分析测试百科网
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qhyu (2015-7-02 22:16:27)
qhyu (2015-7-02 22:16:43)
我扩增的产物片段只要几十个bp,是不是产物小,延伸时间才不需要很长,别人做pcr,扩增时间一般都是几分钟啊!还是文献上的数据有问题啊?
急!!
viviwang1987 (2015-7-02 22:17:01)
普通的PCR只要根据酶的说明书来设定反应时间就可以了，一般TAQ酶每分钟延伸1KB，但甲基化PCR我不知道，希望你解释一下什么叫甲基化PCR？
qhyu (2015-7-02 22:17:24)
甲基化pcr是在做pcr之前,将模板DNA做甲基化修饰,pcr反应及电泳步骤都是一样的!我在分子生物学书上看到:延伸时间与产物片段长度有关,产物在1kb以内的延伸时间为1分钟左右,3kb-4kb的需延伸3-4分钟.我的热启动taq酶说明书上举例的pcr反应条件是:94度30s,55度30s,72度1min,72度5min,前三个一起35个循环.
qhyu (2015-7-02 22:17:51)
我不明白,说明书上,72度1min后,为什么还要72度5min?这是什么意思啊?
tianmei001 (2015-7-02 22:18:16)
QUOTE:
PCR反应的延伸反应通常为72度，接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75度，实际上，引物延伸在退火时即已开始，而Taq酶的作用范围是20－85度。延伸时间的长短取决于目的片段的长度和浓度，一般反应体系中，Taq聚合酶每分钟可合成2kbDNA，而据经验，靶基因每1kb延伸的时间为1分钟，延伸时间过长会导致产物的非特异性扩增，但对低浓度的目的序列，则可适当增加延伸时间。此外，由于DNA的二级结构、DNA碱基错配、反应体系的组分不当等原因，使Taq酶根据底物合成反义链往往不能一次完成，此时Taq酶从底物链上解脱下来，待反应条件合适时又开始扩增，以致会形成不完整的扩增链。所以，一般在扩增反应完成后需要最后一步较长时间（10－30分钟）的延伸，以补平扩增链、获得尽可能完整的产物。对于长片段的扩增，加长延伸时间很有必要，因为长片段扩增的过程中，形成不完整链扩增的机会较短片段扩增的机会似乎多些。该步骤对于后续的克隆和测序非常重要，如通常情况下，一般的Taq酶可以在PCR产物的末端加A尾，以利于TA克隆的进行。但是有实验表明，有些酶如高保真酶(pfu)则不加A尾。qhyu (2015-7-02 22:18:42)
可是我查到的文献上没有末端延伸这一步,不知道是没写还是没做,昨天我扩增了一次,我自己设置了末端延伸72度5min,跑电泳时,除了maker有条带外,其他的都没有扩增出来.不知道是哪里出了问题?
我准备今天再修饰一次,再p一次,不知道pcr条件要不要改?
还望高手指点!
tianmei001 (2015-7-02 22:20:58)
QUOTE:
您的具体PCR和电泳的条件（包括体系和参数）是什么样的，您列出的Taq酶的推荐反应条件是您所应用的吗？一般来讲，对于每一特定的PCR反应，体系和循环册书应该是各自特有的，譬如说引物的Tm值，PCR buffer中的离子强度等主要决定了退火温度的选择，目的片段的大小，主要决定了延伸时间等等，并不是所有的PCR反应都会按照商品化酶的通用条件来做，要想得到好的PCR条带，需要不断的优化PCR的反应体系，考虑到诸如GC等等的因素，况且您的电泳条件如何也影响着您的结果，因为片段为几十bp，需要高浓度（1.5－2.0％以上）的胶，且电影节的时间、距离和电压也很关键！请给出您具体的条件再分析！am10 (2015-7-02 22:21:27)
QUOTE:
片段小，延伸时间一定不能太长，不然，会有很多非特异的产物。qhyu (2015-7-02 22:21:46)
我今天又做了一次pcr,pcr条件完全按文献上的,循环结束后没有最后的5min末端延伸,可是还是没有条带,连引物二聚体都没有!maker很清楚很亮啊!
现在唯一与文献不同的是:文献上的琼脂糖的浓度为4%,而我跑胶的浓度为百分之一点几,真不知道问题出在哪里?是引物的问题?胶的浓度不够?还是pcr条件的问题?请高手帮我分析一下!谢谢!
qhyu (2015-7-02 22:24:19)
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先天性卵巢发育不全综合征
我的热启动taq酶说明书上举例的pcr反应条件是:94度30s,55度30s,72度1min,72度5min,前三个一起35个循环.
文献上的pcr条件及电泳条件: The PCR conditions consisted of 5 min of initial denaturation at 95°C, 35 cycles of denaturation at 95°C for 30 s, annealing for 30 s at 62°C
(unmethylated reaction), 40 s at 65°C (methylated reaction), and elongation at
72°C for 30–45 s. Ten microliters of each PCR reaction product were loaded
onto NuSieve GTG 4% agarose gels (BMA, Rockland, ME) and visualized
under UV illumination.
实际操作中pcr我是按文献上的条件,电泳我用的是百分之一点几的胶,5ulpcr产物加1ul loading buffer点样.已经做了四次了,都没有跑出目的片段,连引物二聚体也没有,其中我还降低了退火温度也没有结果,不知道这是怎么回事?请高手给我出出主意,我用的是博亚合的引物,不知道是不是引物有问题
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