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电化学发光法对水产品中腐胺的研究

2018.11.10

　　腐胺（putrescine， Put）属多价生物胺，化学结构为1， 4-丁二胺，是生物活体或尸体中鸟氨酸脱羧在鸟氨酸脱羧酶的作用下的降解产物[1]。腐胺作为一种腐毒碱存在于腐败物中，适量的腐胺可以促进组织生长，过量的腐胺不仅能加强生物胺的毒性，而且还会与亚硝酸盐反应生成杂环类致癌物[2]。因此，分析和检测食品中的腐胺含量具有极其重要的意义。
　　腐胺的检测方法主要有酶联免疫法[3]、高效液相色谱法[4]、离子色谱法[5]和毛细管电泳法[6]。三联吡啶钌的电化学发光法（ECL）由于其装置简单、重现性好、可进行原位检测以及具有灵敏度高和选择性好的优点[7]，近年来引起人们的广泛关注。
　　本实验研究发现腐胺能有效增强Ru（bpy）32+电化学发光强度。以此为基础，在流通电解池中采用三电极体系，考察了牡蛎原液对Ru（bpy）32+电化学发光的影响，并进行加标回收实验，获得了较理想的结果。
　　1 实验部分
　　1.1 仪器与试剂
　　MPI-E型电致化学发光检测仪（西安瑞迈分析仪器有限责任公司）；腐胺（Sigam，美国）储备液：1.0×10-2mol/L；三联吡啶钌（Sigam，美国）储备液：1.0×10-3mol/L；磷酸盐（沈阳试剂三厂）缓冲溶液（PBS）：0.1mol/L。
　　其他所有试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
　　1.2 实验步骤
　　按照图1的装置，在所建立的ECL分析系统中，铂电极作工作电极（WE），银-氯化银电极作参比电极（RE），不锈钢电极作辅助电极（CE）构成三电极体系接入到电解池内，用蠕动泵将100μL混合试液推入电解池中，停流，以50mV/s的扫描速度，施加0.5～1.5V的正向扫描电压于工作电极，同时记录电化学发光信号随电压的变化情况。以未加腐胺的三联吡啶钌电化学发光强度（IECL）为空白，用相对电化学发光强度（IECL）对腐胺进行定量分析。
　　2 结果与讨论
　　2.1 条件优化
　　可以看出，施加0.5～1.5V的工作电压时，三联吡啶钌（曲线a）只有较弱的电化学发光信号，在工作电压0.5～1.15V时，三联吡啶钌IECL随着电压值增大而增强，在1.15 V后IECL则随着电压值增大而降低，可见，工作电压为1.15V时体系的IECL有最大值；腐胺加入后，三联吡啶钌的电化学发光被极大地增强（曲线b）。基于腐胺对三联吡啶钌电化学发光的增强作用，可建立测定腐胺电化学发光新方法。为此，我们对测定实验条件进行了优化。
　　2.1.1 pH优化
　　由于腐胺的氨基质子化和溶液的酸碱性密切相关，其质子化程度也影响着ECL的强弱。从腐胺的结构上分析：腐胺含有两个伯氨基，且每个氨基的氮原子上有一对孤对电子，孤对电子易与质子结合，因而在酸性溶液中会与氢离子结合形成正离子。当碱性过强时，OH-易在电极上发生氧化反应产生O2，从而影响Ru（bpy）32+的氧化效率和体系的稳定性。与此同时O2对三联吡啶钌激发态具有猝灭效应，故缓冲体系的pH值太低或太高都不利于电极上激发态的形成。基于以上推断，考察了pH值对三联吡啶钌-腐胺体系IECL的影响：在0.1 mol/L PBS中，随着pH增加，IECL逐渐增大；当pH=8.5时，IECL达到最大值；pH继续增大后，IECL有所降低。因此确定本实验最适宜pH值为8.5。
　　2.1.2 三联吡啶钌浓度优化
　　三联吡啶钌作为ECL发光试剂，其浓度大小对电化学发光背景及三联吡啶钌和腐胺共反应体系的电化学发光强度均有很大影响。考察了在0.1mol/L PBS的腐胺体系中，三联吡啶钌浓度对分析信号的影响。可以看出，三联吡啶钌浓度在5×10-7～5×10-4mol/L范围内，IECL随着三联吡啶钌浓度的增加而增强；当三联吡啶钌浓度达到1×10-4mol/L 时，继续增加三联吡啶钌浓度，IECL增大趋势减缓。从经济效益角度考虑，选择三联吡啶钌浓度为1×10-4mol/L。
　　2.2 电化学发光机理探讨
　　基于以上实验，腐胺对三联吡啶钌电化学发光增强作用的机理可能为：当在电极上施加一个合适的氧化还原电位时，Ru（bpy）32+和腐胺同时发生单电子氧化反应，腐胺在电极上氧化后形成的产物（H2N.CH.（CH2）2NH2）将三联吡啶钌在电极上氧化形成的高价态的（Ru（bpy）33+）还原为低价态的Ru（bpy）32+*，Ru（bpy）32+*以光辐射的形式回到基态，产生强发光。因此腐胺能增强三联吡啶钌电化学发光强度[7]。
　　2.3 工作曲线及检出限的测定
　　按照上述优化实验所确定的条件，配制一系列不同浓度的腐胺标准溶液测定其电化学发光强度。随着腐胺浓度的增加，三联吡啶钌-腐胺体系的IECL也随之增强，且与腐胺浓度在10-7～10-4mol/L范围内呈现良好的线性关系，线性方程为ΔI= 65.40C+67.69（C： μmol/L， R2= 0.9975）。对10-7mol/L 腐胺平行测定11次，RSD为3.64%，检出限为8.95×10-8 mol/L。
　　2.4 样品测定　　选取新鲜牡蛎原液作为待测样品，经0.45μm滤膜过滤后，5mL存与冰箱中冷冻备用，5mL置于室温下放置备用，72h后考察不同保存条件下的牡蛎原液对联吡啶钌的电化学发光影响。
　　从表中可以看出，本方法回收率在97.5%～103.4%之间，因此我们所建立电化学发光分析系统能够准确、可靠地执行定量分析任务。
　　3 总结和展望
　　实验表明，基于腐胺对三联吡啶钌电化学发光增强作用，建立了测定腐胺的电化学发光方法，此方法操作简单、灵敏度高、分析速度快，且耗样量少，为食品工业上测定腐胺以及生物胺提供了一种新方法.