蛋白质与多肽激素的放射免疫分析-2

（二）乳过氧化物酶法（LPO）

　　本法反应温和，对抗原、抗体免疫活性影响小，已被广泛应用。缺点是标记率较低，一般为20～40%。

　　1．原理此法是利用乳过氧化物酶（Lactoperoxidase）有促进微量过氧化氢对¹²⁵I^-的氧化作用，生成¹²⁵I⁺，并标记在多肽、蛋白质酪氨酸分子上。

　　2．方法以标记蛋白质抗原为例。

　　（1）反应液组成：蛋白质2～5μg溶于磷酸缓冲液10～25μl中，加入Na¹²⁵i 1m Ci(10μl)、乳过氧化物酶溶液25ng(10μl)、H₂O₂200ng(10μl)；

　　（2）在室温保温7min；

　　（3）加入H₂O₂200ng(10μl)；

　　（4）过7min再加入H₂O₂(3μl)；

　　（5）保温7min后，加入0.5ml、10mmol/L巯基乙醇以停止反应；

　　（6）10min后加入NaI载体溶液1ml ；

　　（7）按常规方法分离纯化。

　　3．注意事项

　　（1）LPO质量好坏，可直接影响标记率，LPO应在使用前新鲜配制，以防酶活性降低。

　　（2）LPO用量应小于总蛋白质用量的1%，以减少酶自身碘化而带入的放化杂质。

　　（3）碘化反应速率分析表明，酶的催化速度很快。

　　（4）碘化反应在pH4.0～8.5较宽范围内均可进行，最适pH值应依据蛋白质本身性质而定。

　　（5）H₂O₂应保持低浓度，如高于0.1mmol/L，对酶的活性将有抑制作用。

　　（三）Iodogen碘化法

　　此法具有标记率高、反应体积小（3ml水平）、可用低浓度的¹²⁵I原料、对多肽激素和蛋白质的免疫活性损失小、稳定等优点，系常规的碘化方法之一。

　　1．原理　用Iodogen为氧化剂，对蛋白质和多肽抗原进行碘化标记，把¹²⁵I直接引进分子中的酪氨酸残基上。标记过程中被标记样品不与Iodogen混合，标记后取出样品即停止反应，不使用任何还原剂。

　　2．方法

　　（1）标记之前，先把Iodogen溶于有机溶剂，涂于管底，并使之干燥。

　　（2）标记时，将蛋白质溶液10～20μg/10μl(0.5mol/L,pH7.5PB)置于反应管中，反应管置于冰浴中。碘化时，¹²⁵I与蛋白质克分子之比例为1～1.2。反应时间在温和的连续的搅拌下可达10min，从反应管中转移出反应混合液，使其反应停止。反应液转移到含有200μl0.01mol/L、pH7.2PB和0.15mol/L NaCl溶液中，层析分离前再放置5min，使其未标记的碘离子还原成分子碘，以避免在带有缓冲液的柱中使白蛋白碘化。

　　3．注意事项

　　（1）涂有Iodogen的反应管，有氮气中密封，并贮存在-20^℃条件下，至少可用3个月。打开管，使用时间很短。

　　（2）碘化反应时间，7min时标记率达最高，10min时略有减少。PH6.0～8.5时，标记率最高。

　　（3）Iodogen与蛋白质的比率是标记率的函数。最大的标记率是1克分子的Iodogen与8克分子或再多量之比。

　　（四）酰化试剂（Bolton和Hunter试剂）法

　　1．原理这个方法用酰化剂3--（4-羟苯基）丙酸—N琥珀酰胺酯（Bolton—Hunter试剂）做连接试剂，将¹²⁵I标记在羟苯基的2，5位置上，再将琥珀酰胺酯水解，通过一个酰氨键将3--（4—羟基—5—¹²⁵I—苯基）接在蛋白或多肽的末端氨基上。

　　2．方法¹²⁵I—Bolton—Hunter试剂可用氯胺T法自行制备，出已有该试剂的苯溶液作为商品出售。使用时取一定量的标记酯（μmol 蛋白用3～5μmol标记酯），用氮气吹除苯，投入欲标记蛋白5～10μg及缓冲液10～50μl,pH8.0～8.5为宜，在冰浴中反应15～30min后，加入多量氨基酸（如甘氨酸），使过量标记酯消耗掉以终止反应。

　　此法避免了蛋白质与氧化剂的接触，又避免了与放射性碘原子的直接接触，可防止碘源中有害物质对蛋白质的损伤，适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后会引起蛋白质的失活。其缺点是标记技术比较复杂，需要接触较多的放射性，经二步反应，碘标记率比较低。一般认为此法不宜标记短肽，而适于分子量大于1万的蛋白质。

　　三、放射性标记化合物的纯化与鉴定

　　（一）纯化标记化合物的常用方法

　　不论使用何种制备方法，要获得合格的标记化合物，都必须将反应物经过仔细的分离、纯化。另外，一些标记化合物，经过一定时间的存放后，往往会出现不纯物，而需再纯化。如碘标记生长激素（¹²⁵--HGH）,在刚标记的第2天，从Sephadex G-100过滤谱上可见，几乎所有的碘化HGH都集中在峰II；保存1个月后，峰II组份减少，峰I和峰III成分明显增加，峰I是集聚的标记生长激素，而峰III是不具有免疫活性的放射性化学杂质（图8--3）。

图8－3　¹²⁵I—HGH的Sephadex G-100过滤谱

实线：新鲜制备的 125I—HGH　虚线：保存1个月的125I—HGH

　　标记化合物的纯化方法，除制备比活度低而化学量又较多的标记物可用重结晶、蒸馏、萃取等常规方法外，一般需用微量分离技术，较方便的是层析法、离子交换法、凝胶过滤及高效液相层析法等。现以碘标记蛋白为例，说明以上各种方法的适用情况。

　　1．凝胶过滤法常用的是Sephadex G系列，也有Biogel—P系列。分离标记蛋白与无机碘时，通常用Sephadex G—25或G—50，然后用G—100进一步纯化。

　　2．离子交换法一般是制成离子交换层析柱，用于分离纯化短肽标记物。

　　3．透析法　能将标记蛋白与小分子化合物很好地分离。

　　4．电泳法可用来分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质。

　　5．亲和层析法利用蛋白质与其特异抗体或受体的结合来分离、纯化标记蛋白质。此法特异性强，保持生物活性好，但操作较复杂。

　　6．高效液相层析法此法最大优点是分离效果好、快速，但需特殊设备。

　　7．伴刀豆球蛋白A（ConA）吸附法ConA是一种植物凝集素，对糖蛋白有良好吸附能力，因此适于分离标记糖蛋白。吸附的标记糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脱。

　　（二）标记化合物的主要质量指标

　　作为示踪剂及分析试剂的标记化合物，应具有比一般非标记化合物更高的质量要求。标记化合物的质量指标包括：放射性核纯度、放射化学纯度、放射性比活度、生物活性和免疫活性以及标记位置和定量分布情况等。

　　1．放射性核纯度及其检查方法

　　（1）放射性核纯芳可用下式表示：

　　放射性核纯度（%）=所需放射性核素的活度/样品的总放射性活度×100

　　（2）放射性核纯度的检查方法：每一种核素都有它的特征，即物理半衰期及射线能量，故可通过半衰期及射线能量的测定来鉴别所需放射性核的纯度。

　　①测定半衰期法：如短半衰期放射性核素，一般可采用时间跟踪法，每隔一定时间测量放射性一次，共测3～5个半衰期，以每次测得的放射性计数为纵座标，时间为横座标，在半对数纸上作图，并通过分析，可求出该放射性核素的纯度。

　　②测定射线能量法：利用每一放射性核素的特征射线谱来检查放射性核纯度。γ发射体可用γ能谱仪，如检测⁵⁷Co和⁵⁸Co的核纯度：纯β-发射体可用液闪仪，调节　道宽及淬火校正后，对如³H、¹⁴C、³²P的核纯度进行测量；而β、γ混杂垓素，则用吸收法测量，如^99mrTc中母体杂质^99mMo的含量测量，是通过适当厚度的铅屏蔽，将^99mTc 发射的能量为141ke V的γ射线减弱后，测定⁹⁹Mo发射的能量为739Kev 的γ射线。

　　2．放射化学纯度及放化纯度鉴定

　　（1）放射化学纯度：放射性核素标记化合物都是以一定的化学形态存在的，所以：

　　放射化学纯度（%）特定化学形态的放射性活度/样品总放射性活度×100

　　放射化学纯度受制备方法及原料的化学纯度、产物存放条件等影响，一般放化纯度控制在95%以上。

　　（2）放射化学纯度的测定方法：原则是高效的化学分离与灵敏的放射性测量相结合。常用下列方法：

　　①放射层析法，又称放射色谱法：本法是利用色谱技术使混合物中各组份分离，然后测定各组份的放射性活度。它具有选择性高、分离效果好、操作简便等优点，在放化纯度鉴定中是一种重要的分析方法。最常用的是放射性纸层析法和放射性薄层层析法。

　　②放射性高效液相层析法：它对分离纯化标记化合物及鉴定标记化合物的放化纯度都有很大潜力，具有分析速度快、分离效率高、适用范围广等特点（几乎80%的有机化合物均可应用）。关键是要选择合适的固定相和流动相，使产品与杂质分离。在流动相中，被分析物各组份的浓度变化可用紫外或荧光检测器检测，而其放射性活度，可同时由放射性探测仪测定。放射性活度测定最简单的一种办法，是将洗脱液分部收集，然后在γ仪或液闪仪上进行测量；另一种较理想的是连续测量，在洗脱液流通池外包围一个固体闪烁探头，进行γ计数或在流通池前加一个三通混合室，用另一个泵混入闪烁液，测定软β射线。可以与紫外控测器的扫描图，同步描绘出放射性的分布图。

　　③放射性核素反稀释法：取一定量（W₁）已测定比活度（S_O）的标记化合物（约0.1～10mg），用>1000倍化学量（W₂）的纯载体稀释，充分混匀后反复纯化到比活度恒定不变（Sp），此标记化合物的放化纯度值应为：

　　有时该值>100%时，往往是由于所用载体化学纯度不够。因本法操作要求严格，一般不作常规放化纯度鉴定用。

　　3．化学纯度及化学量的测定标记化合物中的非放射性化学杂质虽一般不会对示踪结果带来直接干扰，然而这种杂质的含量越多对标记化合物在使用、存放过程中分解、变性的影响就越大。此外，也已发现某些标记化合物的化学杂质会给使用带来直接影响。如用氚标记类固醇作放射免疫分析试剂，其中的化学杂质会影响标记抗原与抗体的结合率，使分析灵敏度降低。因此，对标记化合物的化学杂质含量，同样必须加以控制。

　　要制得化学纯度的标记化合物，最好是对可能产生的杂质加以防止。这要在冷试验中解决。因为冷试验所得产品是非放射性的，其化学纯度可用常规方法，如溶点、沸点测定，NMR、红外、紫外谱分析等手段加以鉴定，得到合格产品后，再按同样方法及条件进行标记制备。

　　对于标记化合物的化学含量，则必需在标记反应及一定纯化步骤后进行，由于需要高比活度的标记化合物，往往样品的放射性很强，而化学量极微（如某氘标记化合物，分子量为300，每分子上标记2个氘原子，氘的同位素活度为99.8%，则理论上每25mCi（925MBq）的化学量还不足（130μg）,所以需用微量分析法才能测定其含量。一般而言，各种常规微量分析技术均可应用。目前大多用紫外分光、荧光光度等进行含量测定。

　　4．放射性比活度及其测定

　　（1）放射性比活度简称比活度，过去也称比放射性。

　　比活度＝放射性活度／单位化学量

　　（2）比活度的理论值计算：每种放射性核素有一个比活度理论值，取决于该核素的半衰期和衰变常数。若N是1毫克原子（1mA）的总原子数，衰变常数λ（单位时间衰变的%），则

　　任何元素每1mA的原子数都相同，等于阿伏加德罗常数，即6.023×10²⁰个，故

　　若T1/2min为单位，则上式的活度单位为dpm/mA,进行单位换算后为：

　　根据上式，可计算出每种放射性核素比活度的理论值（常用放射性核素的比活度理论值见表8-2）。如果标记化合物每分子接上一个放射性核素原子，则以上原论值亦为该标记化合物的比活度（每毫摩尔的活度）理论值。

表8-2 一些常用放射性核素的比活度理论值

　　（亦即每分子一接一个该放射性核素原子的标记化合物的经活度理论值）

　　(3)放射性比活度测定方法

　　①直接测定计算法：将标记产品经分离纯化后，配成合适的溶液，测定每毫升的放射性活度（如mCi/ml）及含量（μg/ml）从而计算其比活度。对于高经活度的标记物，化学含量甚低，一般需用光谱法，如紫外分光光度法测定其含量。

　　②层析扫描面积计算法：一般应用纸层析或薄层层析，将反应结果尚未分离的反应液点样、展层，然后在扫描仪上描绘放射性分布图，根据描绘的面积来进行计算，如图8-4。

图8-4　放射层析扫描面积计算比活度示意图

₁为标记物峰面积：

S₂S₃为杂质峰及放射性原料峰面积

　　先计算标记率：

　　放射性比活度的计算：若投入的待标记物重量为W，且100%转化为标记物，则比活度=A·Y/W，其中A为投入的总放射性。

　　如果层析扫描仪有紫外监测器和放射性活度计数率仪可同步测定扫描，则直接可给出比活度。

　　③自身取代计算法：这是间接测定标记物比活度的方法。所测定的标记物，需是分离纯化后可用于RIA或RRA标记试剂。

　　方法的原理是：作一条常规的RIA（或RRA）标准曲线，另作一条不加非标记标准品，只加抗体和不同量标记试剂的自身取代曲线。两者用同一种抗体，且抗体用量完全相同。若反应平衡后测定结合部分的放射性，掏算成所加总放射性（注意：对标准曲线总说总放射性各管相同，对自身取代曲线来说各管不同，需分别换算）的百分数，即结合率B。由于两条曲线所用抗体的质和量严格相同，标记物与非标记标准品与抗体亲和力也相同，故B的大小就完全取决于各管中标记物和非标记标准品的总量。亦即若从两标准曲线上取一点相同的B，则

　　（标记物+标准品）_标准曲线=（标记物）_{自身取代曲线}

　　故由此便可直接计算标记试剂的化学含量并进一步求得比活度。为求准确度高，可取我点B求出平均比活度。

　　用自身取代法测定标记化合物的比活度，只适用于RIA的标记抗原及受体的标记配基。使用时应注意：①标记物与未标记物对抗体（受体）的亲和力应相同；②非特异性结合应较小，且计算时应扣除；③制备标准曲线与自身取代曲线时，操作步骤应相同，特别是B与F分离的条件要一致。

　5．生物活性、免疫活性测定

　　（10）生物活性、免疫活性测定的重要性：放射性标记化合物作为示踪剂用于生物体内的示踪研究，或作为分析试剂用于生物活性物质分析，都要求标记化合物不改变其原有的生物活性和免疫活性。当给化物引入放射性原子，即使“同位素标记”大多需经过原子交换或化学反应及分离纯化等物理化学处理，有可能造成光学构型及立体构型的改变而使标记物改变性质。“非同位素标记”，如蛋白质分子中引入碘原子，则更易引起蛋白质失活、变性。故测定放射性标记化合物的生物活性和免疫活性，对保证使用效果十分必要。

　　（2）生物活性和免疫活性测定的要求：需根据使用要求而定，因为同一标记物其生物活性的变化与免疫活性的变化不一定相关；同一标记激素，其与受体结合能力的改变与抗体结合能力的改变也不一定平行。

　　（3）测定方法：测定标记蛋白质或多肽的生物活性和免疫活性常用的方法有下述几种：

　　①物理化学方法：可用电泳法、吸附法及凝胶过滤法等物理化学方法来测定标记蛋白质的结构改变情况，如标记后受损全伤的蛋白质在电泳时泳动性减少，碘化受损的多肽激素在血红蛋白涂碳上的吸附性质也有改变，而蛋白质变性聚合时大分子聚合体将在凝胶过滤时不停留在凝胶柱上。这些测定虽较快速方便，但对标记物的生物活性和免疫活性的严格判定来说，还是很不够的。

　　②特异结合试验：根据放射性标记化合物用于放射免疫分析等不同要求，分别与其相应抗体或受体进行特异性结合试验。以放射免疫分析试剂为例，测定其免疫活性的方法是：先观察标记物与抗体的结合率，如果结合率高，说明抗原的免疫活性较好。进一步观察标记抗原与非标记对抗体亲合力是否一致，做法之一是用不同稀释度的抗体，分别与标记抗原及与标记抗原加非标记抗原的混合物进行特异结合，其中混合物抗原总浓度要和单独使用放射性抗原的浓度相同。如单独使用标记抗原1.0ng,而混合抗原的总浓度亦为1.0ng，其中标记抗原为0.1ng，非标记抗原为0.9ng，比较两者的结合率，如果基本相同，说明标记抗原保持其原来的亲和力，在标记等操作过程中未受到明显损伤。如图8-5中，A线与B线基本平行；如果标记抗原免疫活性已有降低，则如C线所示。

图8-5　标记蛋白的免疫活性测定

　　A；为标记抗原与血清的滴度曲线B：为非标记抗原（加入少量标记抗原）的滴度曲线；C：与A相同，但标记抗原免疫活性已有降低

　　③生物特性测定：如¹²⁵I—纤维蛋白原，可用凝血酶测定其可凝能力，与非标记物相比，视是否有改变。使用何种生物特性测定，根据标记物的生物性质而定。另外，上述特异性结合试验，如果受体作异结合剂，也是检验用作RRA或RBA分析试剂的标记物生物活性情况的有效方法。

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第三节　结合和游离部分的分离

　　放射免疫分析时加入的抗原和抗体的量极微，反应所形成的复合物并不能成为肉眼所能辨认的不溶性沉淀物，但是放射免疫分析必须分别测量与抗体结合的（B）和游离的（F）抗原，所以，B、F的分离是放射免疫分析中的一个重要环节　。根据抗原—抗体复合物与游离抗原理化性质或免疫学性质的不同，可采取各种分离技术。

　　一、对分离方法的要求

　　分离方法的选择直接影响分析的质量，通常需满足以下要求：

　　①使B和F分离完全；②不受外界因素的干扰而影响分离效果；③与游离抗原的非特异性作用尽可能小；④操作简便，分离迅速，重复性好，适用于大量样品分析；⑤来源广，价格低廉，便于使用，适合RIA技术自动化。

　　二、常用的分离方法

　　目前用于放射免疫测定中的分离方法很多，各有其优缺点，下面介绍几种常见的分离方法：

　　（1）吸附分离（固相颗粒）

　　活性碳吸附剂（目前常用）

　　硅镁吸附剂（滑石粉等）

　　交换树脂吸附剂

　　（2）蛋白沉淀剂

　　硫酸铵、硫酸钠

　　聚乙二醇（PEG）（目前常用）

　　无水乙醇、丙醇等

　　（3）免疫分离剂（第二抗体）

　　（4）磁性分离剂

　　磁化活性碳吸附剂

　　磁化固相抗体

　　（5）固相包被分离法（固相分离剂包被在测试管内）

　　（一）吸附分离法

　　这种吸附分离剂是固相颗粒，它可以从反应液中吸附游离抗原。

　　活性炭是常用的吸附剂。活性炭多用于小分子游离抗原和抗原—抗体复合物的分离。具体应用时在活怀炭颗粒的表面涂上一层右旋糖酐或蛋白类化合物。这样活性炭末的表面构成一定大小的孔洞，在反应液中加入这种特殊颗粒的混悬液时，小分子的游离抗原被活性炭吸附，达到分离B与F的目的。

　　活性炭吸附方法的优点是操作简便、价廉，缺点是离心沉淀部分是F而不是B，不适用目前自动化放免测定，分离时易受温度和时间的影响。

　　（二）沉淀分离法

　　沉淀分离法的原理，是盐类或有机溶剂能够破坏蛋白质分子表面的水化层而发生沉淀（这种分离要求蛋白质分子处在等电点环境中）。常用的沉淀剂是聚乙二醇（PEG）。PEG是一种直链大分子聚合物，使用PEG溶液时分离沉淀是在有载体血清蛋白或丙种蛋白存在，而且要求γ球蛋白的最终浓度达250mg/ml以上的情况下才能实现。PEG沉淀的结果易受过量的脂类或离心温度的变化影响，PEG离心温度在20^℃以下进行。PEG沉淀的优点是PEG价格低廉，操作简便，一次可处理大量样品。其缺点是PEG单独使用时非特异结合高，所以常与其它方法联合使用；其分离效果易受pH、温度等影响。

　　（三）双抗体分离法

　　双抗体分离法也称免疫分离法，是特异性分离，应用十分普遍。本法是以抗IgG抗体和可溶性的抗原-抗体复合物结合，形成很大的复合物而沉淀。很多抗原的特异抗体来自家兔或豚鼠，称为第一抗体，形成的复合物不能通过离心将其沉淀。或将第一抗体的同种正常动物的血清IgG免疫另一种动物所制得的抗体为第二抗体，该抗体与第一抗体形成不可溶的复合物，经离心可将其沉淀，从而达到分离的目的（图8-6）。