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应用固相萃取（一）

2020.3.29

摘要本文建立了应用固相萃取－高效液相色谱法（SPE-HPLC）测定饲料中磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉等五种磺胺类药物的方法。考察了氧化铝小柱的最大饱和容量及洗脱条件，优化了色谱条件：流动相为乙睛和水（25:75,v/v）,流速为1.0mL/min，检测波长为270nm。在优化条件下，方法检出限为0.1μg/mL，线性范围在0.2μg/mL～200μg/ mL之间，线性相关系数高于0.9996。将该方法用于鸡配合饲料、猪配合饲料和浓缩饲料中磺胺类药物残留的测定，不同添加浓度的回收率均高于80%，相对标准偏差≤10％，能够满足实际样品的分析要求。

关键词固相萃取；高效液相色谱法；磺胺类药物；

1．引言

磺胺类药物（Sulfonamides, SAs）都具有对氨基苯磺酰胺结构，广泛用于预防和治疗细菌感染性疾病。集约化养猪场常用抗生素药物混入饲料中防治疫病,磺胺类药物其比例一般是:预防量100—200PPM,治疗量300-500PPM。

磺胺类药物的测定方法报导的文献有很多，基本上都是用高效液相色谱或液质的方法测定动物组织、血液、蛋、奶、蜂蜜中的7-11种磺胺。过程相差不大：有机相除蛋白→乙睛提取→碱性氧化铝SPE柱净化→浓缩→高效液相色谱紫外检测（或柱后衍生，荧光检测）或高效液相色谱-质谱检测。由于饲料样品成分的多样性和复杂性使得测定其中磺胺类药物难度较大，文献报导也较少。在这篇文章中，我们详细的阐述了用乙腈作为提取剂、通过碱性氧化铝SPE小柱净化后反相高效液相色谱仪紫外检测器检测饲料产品中五种磺胺的残留量。

2．实验部分

2.1仪器

WATERS600型高效液相色谱仪，C18色谱柱（5µm ，250mm×4.6mm）。选用乙睛和水作为流动相，乙睛和水体积比例为25:75,流动相的流速为1.0mL/min；WATERS474二极管阵列检测器,波长为270nm；WATERS 717plus 自动进样器，进样量为 20µL。

2.2 试剂及材料

乙腈和甲醇为色谱纯（Fisher公司）；冰醋酸为优级纯（国产）；其它试剂为分析纯，国产，

未进一步处理直接使用。磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉标准品（Sigma公司，纯度>99%）；碱性氧化铝SPE 小柱:Speed SPE Cartridges Alumina Basic ALB (ABI公司) ，规格为1000mg/12mL；

2.3 标准溶液的配制

分别配制五种磺胺的标准贮备液，浓度为1mg/mL，乙腈溶解（注：磺胺喹恶啉用甲醇溶解）。－20℃冰箱保存一个月。标准工作液现用现配，用流动相定容。

2.4 样品前处理

2.4.1提取称取配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料样品2g，置于具塞锥形瓶中，加入50 mL的乙睛于振荡器振荡提取30min，过滤，滤液备用。

2.4.2 净化准确吸取试液(２.4.1)：配合饲料10～20mL；浓缩饲料、添加剂预混合饲料2 mL,移入用10mL乙睛淋洗过的碱性氧化铝小柱中,令其自然流速流出。待试液全部流出后，吹干，用两次2mL流动相洗脱，收集洗脱液, 并过0.45um的滤膜，滤液上机测定。

3.结果与讨论

3.1色谱条件的优化

考察了乙睛+水+冰乙酸流动相体系，结果如图所示（见下图）。通过色谱图可知，在乙睛，水和冰乙酸体积比为75：25：3时最为适宜。在此条件下，五种磺胺类药物能够达到基线分离。另外，金霉素、青霉素等药物对其无干扰。

3.2 分析性能

在优化条件下，磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉等五种磺胺类药物在0.2～200μg/mL浓度范围内，浓度与响应强度具有良好的线性关系，线性相关系数高于0.999，相对标准偏差（RSD）小于5%。结果见表2：

全屏显示表格

目标分析物	回归方程	线性范围	线性相关系数	LOD	RSD
磺胺嘧啶	Y=0.0796+0.0000222x	0.2-200 μg/mL	0.9999	5mg/kg	1.05%
磺胺二甲基嘧啶	Y=0.074+0.0000249x	0.2-200 μg/mL	0.9999	2mg/kg	2.34%
磺胺间甲氧嘧啶	Y=0.0123+0.0000254x	0.2-200 μg/mL	0.9999	5mg/kg	2.35%
磺胺甲恶唑	Y=-0.0220+0.0000241x	0.2-200 μg/mL	0.9999	2mg/kg	0.88%
磺胺喹恶啉	Y=0.456+0.0000300x	0.2-200 μg/mL	0.9996	2mg/kg	1.26%

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周锦帆