应用固相萃取（二）
3.3 样品的前处理
3.3.1 提取剂的选择
饲料组成极为复杂，对磺胺类药物的提取和测定干扰较大。在本研究中，考察了甲醇、70%酸性甲醇、乙睛和95%乙睛水四种提取剂的提取效果及对测定的影响。结果如图所示。
由图可知以甲醇和70％的酸性甲醇为提取剂时，色谱图基线不平，可能影响样品的测定。而95%乙
睛水对碱性氧化铝小柱具有穿透作用，使得目标分析物流失。因此，选择乙睛作为提取剂。
3.3.2 碱性氧化铝小柱饱和容量
考察了氧化铝小柱的最大饱和容量，将标准溶液10μg/mL分别上柱2 mL、5 mL、10 mL、20 mL、30 mL，结果如表3所示。由表中结果可知，碱性氧化铝小柱对磺胺类药物的承载量小于200μg。而磺胺类药物在配合料中的添加量约为100～200mg/kg，在添加剂预混合饲料中大于1000mg/kg，在称样量为2g时，配合饲料上样量定为10mL；添加剂预混合饲料上样量定为2mL。
表3 碱性氧化铝SPE小柱穿透性结果—下滴液中SAs百分率
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上柱浓度（mg） | 20 | 50 | 100 | 200 | 300 |
磺胺嘧啶 | / | / | / | 1.4 | 17.2 |
磺胺二甲基嘧啶 | / | / | / | 5.7 | 42.0 |
磺胺间甲氧嘧啶 | / | / | / | / | 9.7 |
磺胺甲恶唑 | / | / | / | 2.5 | 24.2 |
磺胺喹恶啉 | / | / | / | 3.0 | 27.7 |
3.3.3 洗脱剂的选择
考察了75%乙睛水、25%乙睛水和纯水三种洗脱液，每次用2mL洗脱液，洗脱3次，结果见表4。由表中结果可知，75%的乙睛水洗三次后仍有个别磺胺类药物未被洗脱；而25%乙睛水、纯水在三次洗脱后，洗脱液中已无任何磺胺类药物。由于25%的乙睛水恰恰是流动相的组成，因此确定用25%的乙睛水2mL洗脱两次
表4 洗脱剂的选择—不同洗脱剂分次洗脱百分率（%）（100ng标准溶液）
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洗脱剂 | 75%乙睛水 | 25%乙睛水 | 水 | |||||||
1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | ||
磺胺嘧啶 | 65 | 34.6 | 2.4 | 100 | / | / | 100 | / | / | |
磺胺二甲基嘧啶 | 92.2 | 9.4 | / | 100 | / | / | 100 | / | / | |
磺胺间甲氧嘧啶 | 84.1 | 17.4 | / | 100 | / | / | 100 | / | / | |
磺胺甲恶唑 | 88.6 | 14.6 | 1.3 | 100 | / | / | 100 | / | / | |
磺胺喹恶啉 | 93.9 | 11.2 | / | 100 | / | / | 100 | / | / | |
3.4 样品的测定
将该方法用于鸡配合饲料和猪配合饲料中磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉等五种磺胺类药物的测定。考察了20μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL浓度水平加标回收，回收率结果见表5。在鸡配合饲料中，四个浓度水平的磺胺类药物的回收率高于77.7%，RSD≤；在猪配合饲料中，四个浓度水平的磺胺类药物的回收率高于80.2%，RSD≤；由于在猪浓缩饲料中磺胺类药物添加量较高，因此只考察了一个浓度水平的回收率，结果见表6。
表5（1） 鸡配合饲料中五种磺胺类药物的回收率
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20 mg/kg | 100 mg/kg | 200 mg/kg | 400 mg/kg | |||||
回收率(%) | RSD (%) | 回收率(%) | RSD (%) | 回收率(%) | RSD (%) | 回收率(%) | RSD (%) | |
磺胺嘧啶 | 99.3 | 6.9 | 78.5 | 6.0 | 81.3 | 2.0 | 90.0 | 1.6 |
磺胺二甲基嘧啶 | 101 | 5.9 | 87.3 | 2.9 | 82.1 | 3.0 | 89.9 | 2.2 |
磺胺间甲氧嘧啶 | 99.2 | 6.0 | 77.7 | 4.4 | 85.3 | 2.8 | 80.4 | 1.0 |
磺胺甲恶唑 | 95.3 | 5.1 | 87.3 | 3.8 | 87.8 | 3.7 | 85.5 | 0.99 |
磺胺喹恶啉 | 98.3 | 8.0 | 86.9 | 7.0 | 90.4 | 4.0 | 90.3 | 2.7 |
表5（2） 猪配合饲料中五种磺胺类药物的回收率
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20 mg/kg | 100 mg/kg | 200 mg/kg | 400 mg/kg | |||||
回收率(%) | RSD (%) | 回收率(%) | RSD (%) | 回收率(%) | RSD (%) | 回收率(%) | RSD (%) | |
磺胺嘧啶 | 101 | 7.9 | 80.2 | 4.7 | 88.2 | 2.1 | 89.7 | 1.0 |
磺胺二甲基嘧啶 | 105 | 4.2 | 82.4 | 3.3 | 87.7 | 2.8 | 83.2 | 0.56 |
磺胺间甲氧嘧啶 | 100 | 6.6 | 80.4 | 2.9 | 86.8 | 1.9 | 87.5 | 1.2 |
磺胺甲恶唑 | 91.5 | 4.1 | 89.8 | 4.3 | 80.4 | 2.0 | 82.1 | 2.3 |
磺胺喹恶啉 | 104 | 8.7 | 89.1 | 5.0 | 87.4 | 3.6 | 88.8 | 1.8 |
表6 猪浓缩饲料中磺胺类药物的回收率
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添加量(mg/kg) | 测得量(mg/kg) | 回收率(%) | RSD(%) | |
磺胺嘧啶 | 400 | 325.2 | 81.3 | 4.4 |
磺胺二甲基嘧啶 | 400 | 377.2 | 94.3 | 6.3 |
磺胺间甲氧嘧啶 | 400 | 392.8 | 98.2 | 2.9 |
磺胺甲恶唑 | 400 | 372.0 | 93.0 | 3.5 |
磺胺喹恶啉 | 400 | 384.4 | 96.1 | 7.7 |
4 结论
高效液相色谱法测定饲料中磺胺类药物，方法简单、易于操作，准确度、精密度均符合要求。该方法适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中磺胺类药物的检验。
5参考文献
1 GB/T19542-2004“饲料中磺胺二甲基嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶的测定 高效液相色谱法”；
2 NY5029-2001 无公害食品 猪肉 附录E 磺胺类药物在动物可食性组织中的高效液相色谱检验；
3 Kristof E.Maudens, Quantitative analysis of twelve sulfonamides in honey after acidic hydrolysis by high-performance liquid chromatography with post-column derivatization and fluorescence detection. Journal of Chromatography A,1047(2004) 85-92
4 John D. Weber, liquid chromatography determination of sulfamethazine in milk ,J.ASSOC.OFF.ANAL.CHEM(VOL.72,NO.3,1989)
5 Joe O.Boison ,Determination of Sulfadimethoxine and Sulfamethazine Residues in animal tissues by liquid chromatography and thermospray Mass spectrometry , Journal of AOAC, VOL 78,NO.3, 1995
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