全新双重荧光定量PCR方法助力细菌污染核酸检测
目前，核酸筛检系统（Nucleic Acids Testing，NAT）已广泛用于血制品常规病原体（乙肝、丙肝、艾滋、梅毒）的核酸检测，极大降低了相关疾病的输血传播。但是，在输血感染性风险中，血小板的细菌污染及相关败血症性输血反应仍是棘手的问题。将核酸筛检技术用于细菌污染检测还有不少困难，包括：1、细菌污染不像特定病原体，没有统一的标准品；2、缺少合适的内参质控排除假阳性或假阴性结果；3、核酸扩增聚合酶（Taq）大多是细菌来源，带有痕量的细菌核酸成分。
近期，中国科学院苏州生物医学工程技术研究所血液免疫学研究中心提出一种双重荧光定量PCR方法可提高细菌污染检测的可靠性：设计一条人工核酸序列（IRC）作为内参，其特点是IRC与靶基因共用同一对引物进行扩增，分别用不同荧光探针进行检测。通过精确控制IRC分子数达到阳性检出限，以其Ct(i)值作为阈值，只有样本检测的Ct(s)值小于或等于Ct(i)时，检测结果才可认定为阳性。一种双样本混合的t测验（two samples pooled t-test）统计学方法可用于帮助判断两个Ct值的大小。IRC还可以包装成噬菌体，用于监控核酸样本提取过程。
此外，该双重荧光定量PCR方法可通过分别检测细菌的DNA（脱氧核糖核酸）与RNA（核糖核酸），计算不同Ct的比值，能判断细菌是处于生长繁殖期或者已经是死菌，从而帮助判断血制品灭活的效果。该方法不仅能用于血制品细菌污染检测，理论上也能开发成其他外源基因核酸定量检测的有效方法。
相关研究结果已发表在PLOS ONE（2015，10(7)：e0134743）上。
以上工作得到江苏省自然科学基金、苏州市科技专项项目的支持。
图-1、IRC双重荧光定量PCR原理图
图-2、IRC双重荧光定量PCR性能测试
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