3.13 实时 RT- PCR 验证转录组数据

有两种常用的基因（扩增子）定量检测方法：基因特异荧光探针（如 TaqMan chemistry) 或者特异双链 DNA 结合试剂（SYBR green chemistry )  [22]。我们通过实时 RT-PCR，选择 SYBR green chemistry 来验证 cDNA 芯片发现的 DEG 的表达。不同的基因设计特异引物（见注 32) 。

3.13.1 实时 RT- PCR 反应的准备

( 1 ) PCR 用可视化的 96 孔板在  ABIPRISMA 7500  Sequence  Detection   System 仪器上进行 ( Applied  Biosystems， Foster   City， CA，USA ) 。

( 2 ) 总 RNA  ( 2 μg 脱氧核糖核酸酶处理过的 RNA，来自 3.4 节）用反转录酶和缓冲液（Superscript EIRT， Invitrogen ) 按照说明手册反转录。

（3 ) PCR 反应用 25 μl 体系：100 ng cDNA，12.5 μl 2X 带 SYBR 绿色荧光染料的 Platinum qPCR Super  Mix-UDG  ( Invitrogen ) ，0.5 μl ROX 参照染料（Invitrogen ) ，一对特异引物（每个引物 200 ng) ( 见注 33 ) 。

( 4 ) 所有 PCR 反应用了如下标准温度控制：50℃ 2 min , 95°C 2 min , 40 个循环：95℃ 15s 和 60°C 1 min ( 见注 34)。

3.13.2 实时 PCR 数据提取和分析

( 1 ) 原始数据提取。收集每个样品循环阈值（Ct )  [23]。为了比较不同的 cDNA 样本的 Ct 值，所有比较基因的 Ct 值都根据看家基因 actin 进行标准化 （见注释 35) 。

( 2 ) 数据分析。使用 Pfaffl 推荐的方程式计算选择基因的相对表达量 [24] 。这些算法包括校正基因扩展效率。不同目标基因和参照基因的 PCR 扩增效率估计使用 Ramakers 等 [ 25 ] 推荐的方程式。

3.14 递交芯片数据到公共数据库：ArrayExpress

芯片的数据应存放在公共数据库：ArrayExpress  [ 26 ] 是在欧洲生物信息研究所( EBI) 的高通量功能基因数据的公共数据库 。这个数据库由两部分组成：ArrayExpress 库（MIAME，主要是初级归档）和 ArrayExpress 数据 库（它是不断注释的选择基因表达谱数据库）。ArrayExpress 是 MGED  ( 基因芯片表达数据协会）推荐的三个公共芯片数据库之一。它以保密的形式存储文章使用的数据，允许获得授权的用户，如期刊编辑和审稿入登录数据，文章发表后与其相关的数据可以在指定日期公开。一般情况下，芯片数据提交包括 4 个主要步骤：① 创建一个提交用的新账户（MX 账户）；② 提交程序（芯片制备方案、样品的生长和提取步骤、样品标记、杂交，扫描、分析步骤等）；③ 提交芯片设计（ 名称、设计、技术等） ； ④ 提交实验 （ 实验设计、发表的论文、样品、提取物等）。有关的详细信息请参阅网页： http ://www .   ebi.   ac.   uk/ miamexpress/ Help。

3.15 统计模型

剩余最大似然法（REML 法） [ 27 ] 在 GenStat 第 7 版 （ 2003年）统计系统中应用 ，适合于混合模型（ 包括随机和固定效应），以从任何特定比较（ 如 14dpa 的 B102-1-1与 L88-31 ) 中，每个基因多达 6 个观察值，建立一套完整的数据集。根据模型偏差估算实验设计中由生物学重复和技术重复所组成的方差，不同的模型之间进行测试时，随自由度变化的其方差变化服从 x2 分布。使用 Wald 检验 [ 28 ] 评估模型中的固定效应，测试统计量也服从 x2 分布。因此，建模考虑了设计上的变异效应（ 随机效应）和固定效应 （ 9246 个基因）。经过随机和固定参数（term) 的显著性评估，在 14dpa 的 B 102-1-1 和 L 88-31 比较模型是：